免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

一、实验基本原理

    抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以期达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。 

二、标本分类

    实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

三、抗体介绍

    免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

四、常用染色方法

    根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。

五、免疫组化方法的具体实验流程步骤

1、SP三步法

1）石蜡切片，常规脱蜡至水。

2)  0.3%或3%H₂O₂去离子水(无色液体)孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。

3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟

4）候选步骤：采用抗原修复：微波(建议30分钟内4次中火)、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟*3次.

5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。

6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜(最好复温)。PBS冲洗，3分钟*5次。

7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟-1h。

8)  PBS冲洗，3分钟*5次。

9）滴加SP(链霉亲和素-过氧化物酶)，室温或37℃孵育30分钟-1h。

10) PBS冲洗，3分钟*5次。

11）显色剂显色(DAB等)。

12）自来水充分冲洗。

13）可进行复染，脱水，透明。

14）选择适当的封片剂封片。

2、即用型二步法

1）脱蜡、水化组织切片。

2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。

3) 0.3%或3%H₂O₂去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。

4）滴加一抗，室温或37℃孵育30~60分钟，或4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。

5）滴加Enhangcer增强剂，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分钟*5次。

6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗，3分钟*5次。

7）应用DAB溶液显色。

8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。

三、免疫荧光技术

1. 酶免疫组化的关键环节

1）标本固定：

①固定的目的是防止标本从玻片上脱落；

②除去妨碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；

③固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选用Bouin’s液或mDF液效果较好。

2）脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。

3）脱蜡和水化：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60℃20min，然后立即二甲苯1-3分别10min(这个时间是由二甲苯新鲜程度和室温等综合决定的)，但当天制好的切片一般先60℃3-4h。水化用梯度乙醇(由高到低)。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

4）抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种(具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等)。我们实验室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右(只要你觉得修复液的温度达室温即可)。

5）细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学(>10um厚切片)和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。同时也是一种去污剂，一般在PBS中加入后终浓度是0.05%即可，而前者终浓度是0.5%-1%。石蜡切片4um左右可以不通透，因为细胞已经被切开了。

6）灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4℃避光保存。不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。

7）血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min。但也要防止封闭过度

8）一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃1-2h，而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min。具体条件还要摸索。

二抗孵育条件：二抗一般室温或37℃30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4℃最佳，反应温和，但时间最好超过16~24h。

9）抗体稀释液：其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因，我一直用国产的专用抗体稀释液，一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果（提示可能一抗没有结合），最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。

10）切片清洗(浸洗、冲洗和漂洗)：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。

注意事项：

① 单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

② 温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；

③ 冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

④ PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄(未见特异性染色)，建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。

注：中性及弱碱性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。

11)DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4℃过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

12）复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救的。方法是：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒(一定动作要快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。

13）封片：为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

2、免疫荧光方法中的重要环节

1）冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。

2）组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。

3）血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。

4）一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃1-2h，而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min。具体条件还要摸索。

5）二抗孵育条件：二抗一般室温或37℃30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。

6）复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。

7）封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

8）切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。

注意事项：

① 单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

② 温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；

③ 冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

④ PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议pH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱碱性条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）

9）拍照：有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。