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适用范围:适用于快速提取全血基因组DNA。
产品储存:本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:
1. 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2. 蛋白酶K保存在即用型甘油缓冲液中,常温运输。收到后,不超过25℃室温至少保存6个月,4℃保存12个月,-20℃保存2年。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍:独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点:
1. 操作安全,不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
2. 快速简捷,单个样品操作一般可在20分钟内完成。
3. 多次柱漂洗确保高纯度,典型的产量200µL全血可提取出3-12µg,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,长度可达30kb -50kb,可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。
4. 从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方,裂解快速完全,客户可根据需要选择购买。
5. 典型的产量200µL全血可提取出3-12µg基因组DNA。
注意事项:
1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
2. 不同样品尤其疾病样品中白细胞数量差异可能非常大,因此产量的个体差异也可能非常大。
3. 需要自备异丙醇。
4. 开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。
5. 为了最佳效果,最好使用新鲜血液标本或者4℃存放少于3天的标本,不要使用反复冻融超过3次的标本,否则会严重降低产量。
6. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保批pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
关于平衡液的使用:
1. 介绍:核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团,提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液,若不小心碰到,请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖,以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成,请加热至37℃使沉淀完全消失。
2. 使用方法:取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中,吸取100μL的平衡液至柱子中。13000rpm离心1分钟,倒掉收集管中废液,将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。
操作步骤(实验前请先阅读注意事项):
提示:第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
1. 取200ul新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液,放入1.5mL离心管。
注:如果全血起始量小于200μL,则用缓冲液BB补足到200μL。如果起始量介于200μL-300μL之间,则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μL-1mL之间,则需要先进行红细胞裂解操作(见本说明书后附录)。
注:如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液,其红细胞为有核细胞,因此处理量5-20μL,可加缓冲液BB补足到200μL后进行后续步骤。
2. 加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液,充分混匀,再加入200μL结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,在70℃放置10分钟。溶液应变清亮(但颜色偏黑色)。
可选步骤,一般不需要:如果RNA残留较多,需要去除RNA,可以在加入200μL结合液CB前加20μL RNase A(25mg/mL)溶液,振荡混匀,室温放置5-10分钟。
平衡液预处理吸附柱备用:使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤,具体方法参见前文“关于平衡液的使用”
3. 冷却后加入100μL异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
注:上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。
4. 将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。
5. 加入500μL抑制物去除液IR,12,000rpm 离心30秒,弃废液。
6. 加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。
7. 加入600μL漂洗液WB,12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。
8. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好),室温放置3-5分钟,12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟。
注:洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于50μL,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
10. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
附录:(以300μL,1mL全血举例红细胞裂解操作)
1. 吸取900μL红细胞裂解液到一个1.5mL离心管或者3mL红细胞裂解液到一个15mL离心管。(红细胞裂解液可向本公司购买)
2. 将抗凝全血(使用前回复到室温)颠倒混匀后,吸取300μL全血和1mL全血分别加到上述1.5mL和15mL离心管中,颠倒6-8次,并倒置轻弹管壁,确保充分混匀。
3. 室温放置10分钟(期间应该颠倒轻弹混匀数次,帮助裂解红细胞)。
4. 12,000rpm离心20秒(对于1.5mL离心管)或2,000-3,000rpm离心5分钟(对于15mL离心管),倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管底的细胞团),留下完整的管底白细胞团和大约10μL的残留上清。
注:离心后在管底应该见到白色的白细胞团,也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起,但是如果看到的是大部分的红色细胞团,说明红细胞裂解很不充分,应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3,4。
5. 加入200μL缓冲液BB涡旋振荡重悬白细胞团,充分分散白细胞团。
注:其中由于肝素抗凝血的白细胞沉淀团很难打散重悬,影响后续实验裂解效果,建议选用非肝素的抗凝剂收集血液标本。
6. 现在可以按照操作步骤提取全血基因组DNA了。
问题与解决方法:
问题 | 评论与建议 |
标本中含有血凝块 | *不恰当的存放标本,未充分混匀,未使用合适的抗凝剂-建议:丢弃有血凝块的标本,重新用EDTA,肝素,柠檬酸剂收集血液。 |
红细胞裂解不完全 | *血液标本裂解前没有回复到室温-建议:处理前先把血液标本回复到室温。 *裂解时间不够-建议:可延长裂解时间至15分钟以上。 *裂解过程中没有混匀-建议:裂解过程中可以更多次颠倒混匀,或者轻弹管壁帮助裂解。 |
DNA产量低 | *血液标本中本身含有的白细胞数量低-建议:增加起始血液处理量。 *血液标本存放时间太长-建议:存放在4℃的血液标本超过5天的产量可能大大降低,因此不要存放太久。 *蛋白酶K失效了-建议:收到蛋白酶K后,按照每次使用量分装冻存,避免反复冻融。 *裂解不完全或者和异丙醇没有充分混匀-建议:加入结合液后,和加入蛋白酶K后立即吹打或者涡旋混匀;加入异丙醇后立即吹打或者涡旋混匀才加入吸附柱,如果太粘稠必须涡旋振荡15秒充分混匀。 *洗脱效率不高-建议:确保做了步骤8,否则残留乙醇会影响洗脱效率,仔细阅读仔细阅读注意事项6和步骤9和只使用洗脱缓冲液EB洗脱。 |
问题 | 评论与建议 |
DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全 | *忘记做步骤8,乙醇抑制了酶切反应-建议:做步骤8,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。 *一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。 |
DNA长度小于15kb | *血液样品太老或者不正确的存放,造成DNA降解-建议:选用新鲜的血液样品。 *操作不当,造成对基因组DNA的剪切-建议:混匀时不可太剧烈,不可以用手剧烈振荡离心管,选用大口径的枪头转移或者混匀DNA。 |
A260吸光值异常偏高 | *一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了吸光值-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。 |
洗脱下来的DNA溶液还带有轻微的颜色 | *漂洗不完全-建议:1.漂洗,直到离心下来的液体没有颜色;2.将洗脱液当成起始材料,再重复一遍实验,注意略去蛋白酶K消化和70℃孵育步骤。 |
品牌: | 爱普科学 |
产品别名: | AipBest Whole Blood Genomic DNA Rapid Mini Kit(Centrifugal Column) |
规格: | 50T/100T/200T |
性状: | 液体 |
储存温度: | RT |
保质期: | 12个月 |
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