适用范围：适用于快速提取各种细菌基因组DNA。

产品储存：本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项：

1. 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

2. 蛋白酶K保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输。收到后，不超过25℃室温至少保存6个月，4℃保存12个月，－20℃保存2年。

3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点：

1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2. 操作安全，不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

3. 快速简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。

4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达30kb—50kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。

注意事项：

1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm 的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。

2. 开始实验前根据需要将水浴预热到37℃或者70℃备用。

3. 需要自备异丙醇。

4. 需自备0.5M EDTA、Triton X-100和Lysozyme(溶菌酶)(用于革兰氏阳性菌)。

5. 结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

6. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保批pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在－20℃。DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0)，但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

关于平衡液的使用：

1. 介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至37℃使沉淀完全消失。

2. 使用方法：取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μL的平衡液至柱子中。13000rpm 离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

操作步骤(实验前请先阅读注意事项)：

提示：第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入！

1. 取0.5-2毫升培养菌液(最多不超过2×109个细胞)，10,000rpm，离心30秒，尽可能的吸弃上清，收集菌体。

注：起始处理量可以根据细菌密度、细胞种类、预期产量进行调整，但是离心吸附柱最大吸附能力是20μg基因组DNA，如果菌体过量超过最大吸附能力，反而会严重降低产量。

2. 加入200μL缓冲液RB重悬，10,000rpm 离心30秒，弃上清。将细胞振荡或者吹打充分重悬于180μL缓冲液RB中。

注：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，可略过第2步骤，加入溶菌酶进行破壁处理，具体方法为：加入180μL缓冲液(20mM Tris，pH 8.0；2mM Na2-EDTA；1.2% Triton X-100；临用前加入终浓度为20mg/mL的溶菌酶(溶菌酶必须用溶菌酶干粉溶解在缓冲液中进行配制，否则会导致溶菌酶无活性))，37℃处理30 min以上。

3. 加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，充分混匀，再加入200μL结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟。

可选做步骤：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μL结合液CB前加20μL RNase A(25mg/mL)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。

平衡液预处理吸附柱备用：使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液的使用”

4. 冷却后加入100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

注：上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。

5. 将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm 离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。

6. 加入500μL抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。

7. 加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

8. 加入600μL漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

9. 将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm 离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好)，室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm 离心1分钟。

注：洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于30μL，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

11. DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。

问题与解决方法：

产品说明书.pdf