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储存条件:冰块运输,2-8℃保存,保质期2年。
产品说明:rProtein A/G Magnetic IP/Co-IP Kit是一款能够高效完成免疫沉淀(IP)及免疫共沉淀(Co-IP)实验的试剂盒。其包含高性能rProtein A/G MagPoly Beads,能够实现快速便捷的磁性分离。另外试剂盒内经过优化的缓冲液,为免疫沉淀实验提供了良好的反应条件,增强了免疫沉淀实验的稳定性。聚合物磁珠的配体是重组蛋白A/G(约14 kDa),同时拥有蛋白A和蛋白G的IgG结合结构域,具有更广的抗体亚型结合范围。试剂盒的洗脱方式多样,既可以用低pH的洗脱液将免疫复合物从蛋白A/G磁珠上洗脱,也可以使用电泳上样缓冲液以变性条件洗脱免疫复合物,直接进行后续检测分析。本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。
操作步骤:
一、缓冲液的准备
1. 可使用试剂盒准备的缓冲液,也可根据实际情况配制不同的缓冲液体系。Lysis/Wash Buffer(5×)在使用前请稀释至并标记为1×Lysis/Wash Buffer,另根据需求,补加终浓度为0.1%-1% 的Lysis/Wash Buffer Enhanced,标记为1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)。所有缓冲液在使用前建议用0.22um或者0.45um滤膜过滤,稀释后的缓冲液建议4℃保存,若试剂浑浊,请立即丢弃。
2. 下列可能用到的试剂及材料未提供,需额外准备:
1) 电泳上样缓冲液,非还原性(5×):0.3 M Tris-HCl(pH 6.8),5% SDS,50% 甘油,0.5% 溴酚蓝
2) 二硫苏糖醇(DTT)
3) 蛋白酶抑制剂
4) 免疫沉淀所用抗原、抗体
二、样品准备
方案1:贴壁细胞的裂解
1) 小心去除单层细胞的培养基。
2) 用预冷PBS清洗细胞两次。
3) 根据下表的推荐体积向细胞中加入预冷的1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)。冰上孵育5 min,期间混匀几次。
4) 将上述裂解好的样品转移至一个新的离心管中,约13,000xg离心10 min,分离细胞碎片。
5) 将上清转移到一个新管中,进行蛋白浓度测定及后续实验,标记为细胞裂解样品。
注:针对各种标准培养皿的1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)的推荐使用体积。
方案2:悬浮培养细胞的裂解
1) 将细胞悬液以1,000xg离心5 min,收集细胞,弃上清。
2) 用预冷PBS将细胞团轻轻重悬,将细胞悬液以1,000xg离心5 min,收集细胞,弃上清。
3) 向细胞团块中加入预冷1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)。每50 mg细胞团块使用500uL。
4) 将上述裂解好的样品在冰上孵育5 min,期间混匀几次。13,000xg离心10 min,去除细胞碎片。
5) 将上清转移到一个新管中,备蛋白浓度测定及后续实验,标记为细胞裂解样品。
三、免疫沉淀:抗原、抗体与磁珠的结合顺序可根据实际情况调整,不同的孵育顺序对最终纯度及抗原产量均有影响,以下方案为推荐常用的实验方法。
1. 磁珠漂洗
1) 将rProtein A/G MagPoly Beads充分混匀,取20uL(0.2 mg)加入1.5mL离心管中。
2) 向磁珠中加入180uL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced),轻微涡旋混匀。
3) 将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸弃上清。
4) 向离心管中加入1mL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced),颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1 min,将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸弃上清。
2. 免疫沉淀
方案1:
1) 向上述准备好的磁珠(步骤2.3.1)中加入抗体,抗体推荐用量2-10ug,用抗体保存液或1×Lysis/Wash Buffer补充体积至500uL,室温混旋孵育30 min,将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸取上清,留样用于检测。
注:孵育温度和时间范围推荐为:室温 0.5h-2h 或者4℃ 1h-16h,根据实际的结合效果进行调整。
2) 向离心管中加入500uL 1×Lysis/Wash Buffer,颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1 min,将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸弃上清,重复至少两次。
3) 向离心管中加入500uL细胞裂解样品(步骤2.2),每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为500-1000ug,体积不足500uL可用1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)补足,室温混旋孵育30 min,将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸取上清,留样用于检测。
注:孵育温度和时间范围推荐为:室温 0.5h-2h 或者4℃ 1h-16h,根据实际的结合效果进行调整。
方案2:
1) 在离心管中,将细胞裂解样品(步骤2.2)与抗体混合孵育30 min。推荐抗体用量为2-10ug,每个免疫沉淀反应推荐的细胞裂解液总蛋白量为500-1000ug,体积不足建议用1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)将样品体积调整至500uL。
2) 将孵育后的样品加入准备好的磁珠(步骤2.3.1)中混旋孵育。
注:孵育温度和时间范围推荐为:室温 0.5h-2h 或者4℃ 1h-16h,根据实际的结合效果进行调整。
3) 将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸取上清,留样用于检测。
3. 磁珠漂洗
1) 向离心管中加入500uL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced),颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1 min,将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸弃上清,重复一次。
2) 向离心管中加入500uL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced),连同磁珠转移至一个新EP管中,颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1 min,将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸弃上清。
4. 洗脱
方案1(低pH洗脱):向离心管中加入50uL Elution Buffer,室温混旋孵育10 min,将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸取上清为洗脱液,加入5-10uL Neutralization Buffer。
方案2(备选变性洗脱方法):向离心管中加入50uL(1×)电泳上样缓冲液,将样品置于金属浴中,96-100℃加热10 min。通过磁分离器分离磁珠,保留含有目的抗原的上样缓冲液。
注:两种洗脱方案均包含捕获抗体及目的抗原,低pH洗脱样本中抗体为完整结构,变性洗脱样本中抗体解离为重链、轻链,请根据后续实验需求选择洗脱方案。
注意事项:
1. 在进行免疫沉淀操作之前,请务必认真阅读此说明书。除非另有说明,所有操作建议于4℃下进行。
2. 在保证洗杂效果的前提下,如果使用1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)洗杂,会造成抗体和介质,或者抗原和抗体之间结合效果降低,建议可以使用1×Lysis/Wash Buffer进行洗杂。
3. 如果需要在还原条件下洗脱,向1×电泳上样缓冲液中加入DTT(终浓度10-20 mM)。
4. 磁珠应保存在储存溶液中,防止干燥,使用前请充分混匀。
5. 经煮沸后的填料容易聚集并且失去抗体结合能力,经煮沸的填料不应再次使用。
6. 为保证最佳的实验结果,请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应。对于免疫沉淀实验,不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的,有时抗体与抗原结合还会受到影响,因此,若本试剂盒提供的缓冲体系不能获得很好的实验结果,可自行优化缓冲液进行实验。
7. 实验设计时,建议加入对照组,以备后续实验结果分析使用。在确定实验结果前,建议保留各步骤抗原、抗体孵育后的样品以备验证。
8. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套和口罩操作。
9. 本产品仅限专业人士的科研使用,严禁用于临床诊断和药物等用途。
注意事项:
附表:
品牌: | 爱普科学 |
英文名称: | rProtein A/G Magnetic IP/Co-IP Kit |
规格: | 10T/50T |
性状: | 液体 |
储存温度: | 2-8℃ |
保质期: | 12个月 |
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