适用范围：适用于快速提取细菌/外泌体等microRNA或microRNA/总RNA分别提取。

产品储存：本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。不合适的储存于低温(4℃或者－20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下(15℃－25℃)进行。

产品介绍：

    本试剂盒在我公司领先的RNA/microRNA提取技术的基础上，创新性的采用了不用苯酚、氯仿等有毒试剂的技术路线，精心研制而成。传统的microRNA提取试剂盒均是采用异硫氰酸胍/苯酚/氯仿(TRIzol法)加高浓度乙醇硅胶膜吸附小片段microRNA的原理方法制成，但是该方法因为使用了有毒的苯酚/氯仿，因其对身体的毒性致癌作用和环境保护的影响受到越来越多的限制。同时TRIzol法原理适用范围窄，对于某些特殊样品(包括细菌样本)，提取microRNA效果不佳。

    本试剂盒配备了独特的通用裂解液，可迅速裂解细菌和灭活细菌RNA酶，然后裂解混合物通过基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA(包括microRNA)被选择性滤过。滤过的RNA/microRNA用乙醇调节结合条件后，在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列特殊漂洗液快速的漂洗－离心的步骤，将细胞代谢物和蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-free Water将纯净的RNA(包括microRNA)从硅基质膜上洗脱。

    本试剂盒采用分提取操作步骤也可单独纯化富集后的microRNA组分和总RNA(>200 nt)，从而得到分离富集的microRNA和RNA。

产品特点：

1. 操作安全，完全不使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2. 快速简捷，全程操作只需12步，单个样品操作一般可在40分钟内完成，比传统 microRNA提取试剂盒大大减少了操作时间和步骤。

3. 功能强大，既可以得到总RNA(包含了microRNA)，也可以采用分提取操作步骤单独纯化富集后的microRNA组分和总RNA(>200nt)，从而得到分离富集的microRNA和RNA。

4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达2.0～2.2，可直接用于RT-PCR、荧光定定量PCR、Northern-Blot等相关分子生物学实验。

注意事项：

1. 第一次使用前请先在Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入。Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用即可。

2. 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子密封保存。

4. 所有的离心步骤均可在室温完成(4℃离心也可以)，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

5. 需要自备乙醇，研钵(可选)、Lysostaphin(样品为金葡菌时需准备)等。

6. 样品处理量绝对不要超过基因组DNA清除柱和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。

7. 裂解液ALB和Wash Solution 1中含有刺激性化合物，操作时需穿防护服并佩戴一次性手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

8. 预防RNase污染及实验前的准备：经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。使用RNase-free的塑料制品和枪头避免交叉污染。RNA提取过程中应使用RNase-free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH 中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。配制溶液应使用RNase-free的水或DEPC水(DEPC水的制备：将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌)。

9. 关于DNA的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留(DNase消化也无法做到100%无残留)，该产品由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，个别特殊情况需要清除微量基因组DNA残留，可使用以下几种DNA酶消化的方式。

1) 传统DNA酶消化提取的RNA/microRNA，热灭活DNA酶后直接用于后续实验。

2) 传统DNA酶消化提取的RNA/microRNA，然后使用增强型RNA清洁纯化试剂盒(货号：RE282)清洁纯化后用于后续实验。

3) 直接在吸附柱RA上进行DNase I 柱上消化处理。可购买爱普科学的AipPure DNase I柱上消化试剂盒(RNase-free)(货号：RE280)，但是需将说明书的去蛋白液 RW1改成Wash Solution 1，可先索取具体操作说明书。

操作步骤(提取包含microRNA的总RNA)：

提示：第一次使用前请先在Wash Solution 1和Wash Solution 2/3瓶中按照标签提示加入指定量无水乙醇！并打钩做好标记避免重复加入！提取细菌RNA需先配制加了溶菌酶或Lysostaphin的TE溶液(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA)，确保TE溶液中已加入溶菌酶或Lysostaphin(浓度为1mg/mL)。

1. 离心收集1-2mL菌液(10⁸-10⁹细胞)到新的1.5mL离心管, 尽可能去除上清。

2. 根据细胞的种类和数量，充分重悬细胞在100μL(5*10⁸细胞)/200μL(5*10⁸-7.5*10⁸细胞)TE溶液中(10mM Tris-HCl，1mM EDTA)，确保TE溶液中已加入溶菌酶或 Lysostaphin(浓度为1mg/mL)或者直接用TE溶液重悬后，用干净枪头挑取少许溶菌酶加入。

3. 室温(15-25℃)温育5分钟/溶菌酶，或者 37℃温育15分钟/Lysostaphin，破解细胞壁，期间每2分钟涡旋振荡10秒辅助破壁。

注：各种细菌破壁的难易程度不一样，一般革兰氏阴性菌E.coli使用上面的条件就足够了，甚至可能省略该步骤，但是某些革兰氏阳性菌如B. subtilis难破壁需要提高溶菌酶浓度到15mg/mL和温育时间到10分钟。如果金黄色葡萄球菌需要加入 Lysostaphin到1mg/mL，37℃温育15分钟。总之不同细菌类型破壁难易程度不同，有的难破壁的种类需要根据用户自己的具体情况调节酶的种类、工作浓度、温育温度和时间等，此外还可以联合使用玻璃珠击打、机械破壁、蛋白酶K消化等方法帮助破壁。

4. 短暂离心收集细菌，彻底弃上清后加入500μL裂解液ALB，涡旋振荡或者用吸头吹打混匀帮助裂解细菌。

5. 将裂解匀浆液全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。立即12,000rpm离心 1分钟，收集滤液(RNA/microRNA在滤液中)。

6. 用微量移液器较精确估计滤过液体积(480μL左右，滤过时损失体积应该减去)，加入1.25倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

7. 立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)12,000rpm离心30秒，弃掉废液。

注：确保离心后液体全部滤过，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

8. 加入700μL Wash Solution 1(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

9. 加入500μL Wash Solution 2/3(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μL Wash Solution 2/3，重复操作一遍。

10. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

11. 取出吸附柱RA，放入新的RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μL RNase-free Water，室温放置1分钟，12,000rpm 离心1分钟，洗脱收集RNA溶液，得到的RNA/microRNA可以立即用于下游反应或尽快-70℃保存，防止降解。

注：将洗脱液重新加回到吸附柱按照步骤11重新洗脱一遍，可以提高产量约10-15%。如果预期RNA产量>30μg，加30-50μL RNase-free Water重复步骤11操作，合并两次洗脱液，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据实验需要自行选择。

附录1：microRNA相对富集方法(microRNA/去除了microRNA的总RNA分别提取)

提示：第一次使用前请先在Wash Solution 1和Wash Solution 2/3瓶中按照标签提示加入指定量无水乙醇！并打钩做好标记避免重复加入！提取细菌RNA需先配制加了溶菌酶或Lysostaphin的TE溶液(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA)，确保TE溶液中已加入溶菌酶或Lysostaphin(浓度为1mg/mL)。

1. 按照标准操作步骤1-4，准备好裂解匀浆液。

2. 在裂解匀浆液加入一半体积的无水乙醇(0.5 体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

3. 将混合物(每次小于720μL，多可以分两次加入)加入一个基因组DNA清除柱中，(清除柱放入收集管中)12,000rpm离心2分钟，保留滤液(microRNA 在滤液中)。

注：此时滤过液含有microRNA，基因组DNA清除柱内溶液是去除了microRNA的总RNA(不包含microRNA)，如果需要，可以按照前面标准操作步骤 4－8操作漂洗，洗脱回收得到去除了 microRNA 的总 RNA。

4. 将混合物(每次小于720μL，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中，(清除柱放入收集管中)13,000rpm离心2分钟，保留滤液(microRNA在滤液中)。

注：此时滤过液含有microRNA，基因组DNA清除柱内溶液是去除了microRNA的总RNA(不包含microRNA)，如果需要，可以按照前面标准操作步骤8-11操作，漂洗、洗脱回收得到去除了microRNA的总RNA。

5. 用微量移液器较精确估计滤过液体积，加入等体积无水乙醇(必须是室温!)，涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。

6. 立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心2分钟，弃掉废液。

注：确保离心后液体全部滤过，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

7. 按照前面标准操作步骤8-11操作，漂洗、洗脱得到富集的microRNA。

注意：不同的实验可以选择不同的方法，例如Northern Blot或者表达芯片谱分析可以选择提取包括microRNA的总RNA。相对富集方法提取的microRNA因为去除了较大片段的mRNA和rRNA等，可能减少某些下游试验的扩增背景，当背景较高或者非特异扩增较多时，可以尝试使用相对富集方法提取的microRNA。总的原则是首选提取使用总RNA(包含了microRNA)做实验，只有确实使用总RNA(包含microRNA）效果不佳的时候，或者实验设计要求必须富集分离microRNA和mRNA，才尝试采用富集microRNA的方法。

附录2：DNA酶柱上消化(详细请参考RE280/DNase I 柱上消化试剂盒说明书)

1. 按照前面所列操作步骤操作，直到做完操作步骤1-7。

2. 取45μL DNase I Buffer和5μL RNase-free DNase I在离心管内轻轻吹打混匀，配制成DNase I工作液

注：处理多个离心柱子要按照比例放大制备工作液。

3. 向吸附柱RA中加入350μL Wash Solution 1，12,000rpm 离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

4. 向吸附柱RA中央加入50μL的DNase I 工作液，室温(20℃-30℃)放置15分钟。

注：直接将工作液滴在膜中央上向膜四周浸润充分和膜接触，不要让工作液滴在O型垫圈上，或离心柱管壁上挂壁，或挂在垫圈上不能充分和膜接触。

5. 向吸附柱RA中加入350μL Wash Solution 1，12,000rpm 离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

6. 立即接操作步骤9，完成后续实验步骤。

产品说明书.pdf