适用范围：适用于快速提取各种全血/血清/血浆/液体样本miRNA和总RNA。

产品储存：本试剂盒按照储存温度保存12个月不影响使用效果。运输在常温下进行，不影响使用效果。

产品介绍：近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15­-30核苷酸左右大小RNA(包括siRNA和miRNA)的试剂盒。但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA，对于血液样本更是由于其自身特点更难提取。本试剂盒采用独特的裂解液迅速直接裂解全血(液体样本)和灭活细胞RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA吸附于离心柱内特殊硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除，最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点：

1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2. 操作便捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成，也不需要乙醇沉淀等容易丧失微小分子RNA的步骤。

3. 爱普科学独有的裂解液配方，可直接裂解全血，无需先裂解去除红细胞操作。

4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留，可直接用于RNAi，RT-PCR，Northern-Blot等相关实验。

注意事项：

1. 第一次使用前请先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入！

2. 70%乙醇、Wash Solution 1和Wash Solution 2/3加入无水乙醇后，可以在常温密封保存。Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用即可。

3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

4. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

5. 需要自备乙醇、氯仿、一次性注射器和研钵等。

6. Lysis Buffer 和Wash Solution 1含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

7. 预防RNase污染及实验前的准备：

1) 经常更换新手套，因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2) 使用RNase-free的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3) RNA在裂解液中不会被RNase降解。但在RNA提取过程中应使用RNase-free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4) 配制溶液应使用RNase-free的水或DEPC水(DEPC水的制备：将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌)。

8. RNA纯度及浓度检测：

完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。如果出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数(10mM Tris，pH7.5)在1.8-2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260和OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度(ng/μL)=(OD260)×(稀释倍数n)×40。

操作步骤(提取包含microRNA的总RNA)：

提示：第一次使用前请先在70%乙醇、Wash Solution 1和Wash Solution 2/3瓶中按照标签提示加入指定量乙醇！并打钩做好标记避免重复加入！

1. 每0.25mL液体样品(血清、血浆、脑脊液等)加入0.75mL Lysis Buffer，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5~10×106个细胞至少加入0.75mL Lysis Buffer。对于含有高污染物样品如全血样品，可以用灭菌水按照1：1比例稀释一倍后开始提取。Lysis Buffer和液体样品的终体积比总是3：1。

2. 将样品剧烈震荡混匀，在15-30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。

3. 每0.75mL Lysis Buffer加0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，并室温下放置2分钟。

4. 4℃ 12,000rpm 离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加Lysis Buffer体积的70%左右。

5. 小心取上清(精确计算体积)转入到新的离心管，加入1.5倍体积的无水乙醇(必须是室温!)，涡旋混匀。此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心，立刻接下步。

6. 将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)12,000rpm离心30-60秒，弃掉废液。

7. 加入700μL Wash Solution 1(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。

8. 加入500μL Wash Solution 2/3(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。再加入500μL Wash Solution 2/3，重复操作一遍。

9. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10. 取出吸附柱RA，放入新的RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μL RNase-free Water(事先在100℃水浴中预热效果更好)，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注：如果预期RNA产量>30μg，加30-50μL RNase-free Water重复步骤10操作，合并两次洗脱液；如果需要RNA浓度高，可使用第一次的洗脱液重新加回到吸附柱重复步骤操作10。洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量高，比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据实验需要自行选择。

附录1：microRNA富集方法(仅仅提取miRNA，不包含>200 nt其它总RNA成份)

1. 按照前面标准操作步骤1-4操作，直到得到上清。

2. 较精确估计上清体积，加入等体积70％乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!必须是室温!)，涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。

3. 将混合物加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)12,000rpm离心30-60秒，收集滤过物。将滤过物从收集管转移到一个新的离心管后，把吸附柱子放回空的收集管内，再加入剩下的混合物，离心，收集滤过物。合并两次滤过物，计算体积。

注：此时滤过物含有microRNA，吸附柱子上面是除去了microRNA的总RNA(不包含microRNA)，如果需要，可以按照前面标准操作步骤7-10操作漂洗，洗脱回收得到去除了microRNA的总RNA。

4. 较精确估计滤过物体积，加入0.65倍体积无水乙醇(必须是室温!)，涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。

5. 取一套新的microRNA吸附柱MA，将上一步骤混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入microRNA吸附柱MA中，(吸附柱放入收集管中)12,000rpm离心30秒，弃掉废液。

6. 按照前面标准操作步骤7-10操作漂洗，洗脱得到富集的microRNA。

注意：不同的实验可以选择不同的方法，例如Northern Blot或者表达芯片谱分析可以选择提取包括microRNA的总RNA。富集方法提取的microRNA因为去除了较大片段的mRNA和rRNA等，减少某些下游试验的扩增背景，当背景较高或者非特异扩增较多时，可以尝试使用富集方法可能提取的microRNA。总的原则是首选提取使用总RNA(包含了microRNA)做实验，只有确实使用总RNA(包含microRNA)效果不佳的时候，或者实验设计要求必须富集分离microRNA和mRNA，才尝试采用富集microRNA的方法。

附录2：DNA酶柱上消化(详细请参考RE280/AipPure DNase I柱上消化试剂盒)

1. 按照前面所列操作步骤操作，直到做完操作步骤1-6。

2. 取45μL DNase I Buffer和5μL RNase-free DNase I在离心管内轻轻吹打混匀，配制成DNase I工作液。

注：处理多个离心柱子要按照比例放大制备工作液。

3. 向吸附柱RA中加入350μL Wash Solution 1，12,000rpm 离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

4. 向吸附柱RA中央加入50μL的DNase I工作液，室温(20℃-30℃)放置15分钟。

注：直接将工作液滴在膜中央上向膜四周浸润充分和膜接触，不要让工作液滴在O型垫圈上，或离心柱管壁上挂壁，或挂在垫圈上不能充分和膜接触。

5. 向吸附柱RA中加入350μL Wash Solution 1，12,000rpm 离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

6. 立即接操作步骤8，完成后续实验步骤。

产品说明书.pdf