产品储存：2-8℃运输，-20℃避光保存，保质期24个月。使用前充分融解混匀，短期使用可放在4℃存放2周。

适用范围：可用于高拷贝、低拷贝基因的检测。部分高GC含量或具有复杂二级结构的RNA模板。

制品说明：

    本试剂盒是具有高效合成效率和高扩增效率的两步法荧光定量PCR试剂盒。

    反转录试剂以RNA为模板，采用预混合技术，用5× HotScript Reaction Mix(已经预混合了HotScript Hˉ RTase、RNase Inhibitor、dNTP Mixture、Buffer)快速高效合成第一链cDNA，操作简单便捷。采用分子进化技术高达60℃的全新高温反转录酶，可以通读GC含量丰富或二级结构复杂的RNA模板，极大提高反转录效率和长度，可用于更长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。本试剂盒中使用了具有DNA分解活性的特殊gDNA Remover，只需一步操作，即可同时完成基因组清除与逆转录反应，极大的简化了实验操作步骤，避免了复杂加样过程中造成的污染与RNA降级的风险。反转录试剂包含合成高质量第一链cDNA所需的所有成分，反转录合成的cDNA产物适用于后续的PCR/qPCR等实验。用户可根据需要，选择Oligo (dT)、Random或基因特异引物作为反转录引物。后续灵活可选的操作步骤，既可合成用于克隆的全长cDNA (可达20 kb)，又可高效合成用于qPCR的各个位置反转录效率均一的cDNA。

    qPCR试剂是采用SYBR® Green I嵌合荧光法进行Real-Time PCR的专用预混型试剂。已经将热启动HotMaster Taq DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液、BSA和SYBR® Green I等试剂预混成一种适合Real-Time PCR反应检测用2× Premix Type试剂，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板、引物和水，便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。采用全新的Hotmaster Taq DNA聚合酶，该酶不同于一般Hot-start酶之处在于，一般的Hot-start酶只在第一步温度升高之前封闭酶的活性，而Hotmaster Taq DNA聚合酶是利用抑制剂通过温度调节方式封闭Hotmaster Taq DNA聚合酶的底物结合位点，温度低于40℃时，形成非活性的酶-抑制剂复合物，当温度升高至引物特异性的退火温度时，结合平衡向模板-特异性引物复合物形成方向移动，因此最大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧光定量PCR反应的精确性。

    qPCR试剂已加入特殊的通用ROX参比染料，具有高通用性，适用于所有型号的qPCR仪器，无需在另外添加ROX，也无需在不同的仪器上调整ROX的使用浓度，操作更简单更便捷，即可快速高效的进行qPCR扩增。ROX主要用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

产品特点：

1. 反转录试剂采用新一代高温反转录酶，极大提高了包括复杂RNA模板的反转录效率和长度，合成cDNA长度高达15kb以上。采用全预混的反转录Mix，并配备了先进的gDNA Remover一步法基因组清除技术，只需一步同时加入gDNA Remover、模板RNA、引物和水，实现cDNA合成和去除基因组DNA同时进行，最快15分钟即可简单快速完成反转录实验。反转录预混合Mix在-20℃不冻结，减少了化冻和混匀时间，使用更简单、更便捷。RNA模板的体积最多可加到总体积的75%，非常适合于低浓度RNA模板的逆转录。用户可根据需要，灵活选择Oligo(dT)、Random primer或基因特异引物作为逆转录引物。

2. qPCR试剂为全预混Mix，采用进口原料和特殊工艺批量生产，质量超稳定，批间差极小，扩增效率强，特异性高，灵敏度好，数据准确。

第一链cDNA合成的引物选择：

1. 如果模板为真核生物来源，一般情况下首选Oligo(dT)，与真核生物mRNA的3'Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。

2. 如果对一些物种，不能确定mRNA是否有poly A尾的情况下，首选Oligo(dT)，不成功再尝试基因特异性引物(GSP)和Random primer为引物。

3. 基因特异性引物(GSP)的特异性最高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成，可改用Oligo (dT)或Random primer重新进行逆转录。

4. Random primer特异性最低，所有RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA均可以作为Random primer的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo (dT)或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random primer为引物。

5. 如果合成cDNA下游用于荧光定量PCR，可将Oligo(dT)与Random primer混合使用(各加1μL/20μL反应体系)，可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同，有助于提高定量结果的真实性和重复性。

第一链cDNA合成：(以20μL反应体系为例)

1. 加入以下成分(使用前将各溶液轻弹或轻微涡旋混匀，可短暂离心以收集残留在管壁的液体到管底)

注：如果反转录时不需要去基因组DNA，直接略去gDNA Remover成分不加即可。gDNA Remover每次按照0.8μL-0.9μL使用，也不影响使用效果。

注：5× HotScript Reaction Mix和gDNA Remover含甘油非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。5× HotScript Reaction Mix内包含的酶均为过量，即使每次按照3.6μL-3.8μL使用，也不影响使用效果。

2. 轻轻混匀

注：如用Oligo(dT)或基因特异引物(GSP)，50℃孵育30-50 min(如产物用于qPCR，50℃孵育15 min)；如用Random Primer，25℃孵育10 min，50℃孵育30-50 min(如产物用于qPCR，50℃孵育15 min)。

注：本制品在42℃-60℃反转录均有稳定良好效果。如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可尝试将反应温度提高至55℃-60℃，有助于提高产量。

3. 85℃加热5 sec失活HotScript Hˉ RTase。

4. 得到的cDNA产物可立即用于PCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-70℃保存。cDNA应避免反复冻融。

RT-PCR：建议取1/10-1/5体积(2-4μL)的反转录产物作为PCR模板；丰度高的可以酌情适当稀释cDNA后使用。

建议PCR条件：请按照选择的爱普科学或其它厂家的PCR试剂说明书进行。

建议爱普科学配套PCR试剂：

常规扩增：GP112-AipMix 2× Taq PCR MasterMix(+Dye)或GP121-AipMix 2× HiFi QuickLong PCR MasterMix(+Dye)

高保真扩增：GP122-AipMix 2× HiFi FastShort PCR MasterMix (+Dye)或GP123-AipMix 2× HiFi FastLong PCR MasterMix (+Dye)

建议PCR条件：(以20μL和50μL反应体系为例，反应液配制请在冰上进行)

说明：本制品兼容性强，适用于不同厂家、型号的荧光定量PCR仪，绝大多数情况下使用二步法和三步法均可获得良好效果。在实际使用中可以根据机型推荐和具体情况对程序加以微调。一般来说，二步法扩增特异性高，三步法扩增效率高。如果融链曲线较差，可以尝试两步法扩增；若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。

注意事项：

1. 操作中注意避免RNase污染，为保证反转录成功，建议使用高质量的RNA模板。

2. 可选步骤(一般不需要)：如果RNA模板GC含量丰富或者有复杂二级结构、或者扩增cDNA长度超过3kb，可以先只加RNA模板、引物和和RNase-free Water混匀，65℃变性5分钟，冰上冷却，短暂离心后加入其它成分继续下面的反转录步骤。

3. qPCR试剂在使用前请轻柔的上下颠倒混匀后进行使用，也可将预混合试剂经短暂离心后混匀进行使用。请勿漩涡振荡混匀，避免产生过量气泡，影响定量结果。

4. qPCR试剂含SYBR® Green I 强光下易分解和降低敏感度，保存和使用时应避免长时间强光照射。建议在冰上配制PCR反应液，再放入PCR仪器中扩增，可以提高扩增特异性，减少背景。

5. qPCR试剂含有4mM MgCl₂(反应体系终浓度是2mM Mg²⁺)，可用25mM MgCl2优化Mg²⁺浓度。

产品说明书.pdf