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HotScript SYBR Green Two-Step qRT-PCR Kit

货号:QP102-01

品牌:爱普科学

货期:现货

价格:1050

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包 装 量:

目录编号

包装单位

QP102-01

RT312-01FP301-01

QP102-02

RT312-02FP301-01

试剂盒组成

货号

产品规格

HotScriptcript First-Strand cDNA

Synthesis RT-PCR Kit

RT312-01

50*20uL

RT312-02

100*20uL

AipMix 2× SYBR Green qPCR

SuperMix

FP301-01

125*20uL

产品储存:-20℃储存,有效期12个月。

产品说明:本产品由两个试剂盒组合而成。

一个是:第一链耐热反转录试剂盒HotScript First-Strand cDNA Synthesis RT-PCR Kit(RT312)

一个是:AipMix 2× SYBR Green qPCR SuperMix

首先由反转录第一链试剂盒合成cDNA,然后以cDNA做模板用2x SYBR Green qPCR Mix进行荧光定量PCR扩增。

使用说明:请按照上述两个试剂详细步骤说明进行实验。

 

RT312使用说明书

包 装 量: 

目录编号

包装单位

RT312-01

50次*20uL

RT312-02

100次*20uL

Components

RT312-01

RT312-02

5× HotScript Reaction Mix

200μL

400μL

Oligo(dT)(0.5μg/μL)

50μL

100μL

Random primer(N6)

50μL

100μL

RNase free Water

1mL

1.5mL

产品储存:-20℃保存,有效期12个月。

制品说明:

    本制品以RNA为模板,采用预混合技术,用5× HotScript Reaction Mix(已经预混合了HotScript Hˉ RTase、RNase Inhibitor、dNTP Mixture、Buffer)高效合成第一链cDNA,操作简单。

    本制品采用分子进化技术高达60℃的全新高温反转录酶,可以通读GC含量丰富,二级结构复杂的RNA模板,极大提高反转录效率和长度。可用于更长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。

适用范围:第一链cDNA合成。可用于高拷贝、低拷贝基因的检测。尤其GC含量高,复杂模板的高温反转录

产品特点:

1. 新一代高温反转录酶极大提高了包括复杂RNA模板的反转录效率和长度。合成cDNA长度高达15kb以上。

2. 全预混的反转录Mix,只需加入RNA、引物和水,简单快速完成反转录。

3. RNA模板的体积最多可加到总体积的75%,非常适合于低浓度RNA模板的逆转录反应。

4. 预混合Mix在-20℃不冻结,减少了化冻和混匀时间,使用更简单。

5. 用户可根据需要,可灵活选择Oligo(dT)、Random primer或基因特异引物作为逆转录引物。

引物选择:

1. 如果模板为真核生物来源,一般情况下首选Oligo(dT),与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对,可获得最高产量的全长cDNA。

2. 如果对一些物种,不能确定mRNA是否有polyA尾的情况下,首选Oligo(dT),不成功再尝试基因特异性引物(GSP)和Random primer为引物。

3. 基因特异性引物(GSP)的特异性最高。但有些情况下,用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成,可改用Oligo (dT)或Random primer重新进行逆转录。

4. Random primer特异性最低,所有RNA,包括mRNA,rRNA,tRNA均可以作为Random primer的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高,或者模板为原核生物来源,使用Oligo (dT)或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成时,可使用Random primer为引物。

5. 如果合成cDNA下游用于荧光定量PCR,可将Oligo(dT)与Random primer混合使用(各加1μL/20μL反应体系),可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同,有助于提高定量结果的真实性和重复性。

第一链cDNA合成:(以20μL反应体系为例)

1. 加入以下成分(使用前将每种溶液轻弹或者轻微涡旋振荡混匀,可简短离心收集液体到管底。)

Components

Volume

Total RNA/mRNA

50ng-5μg/5-500ng

Oligo(dT)(0.5μg /μL) or

Random Primer(0.1μg/μL) or

GSP(Gene Specific  Primer, 2pmol/μL)

1μL

5× HotScript Reaction Mix

4μL(见注意事项4)

RNase free Water

to 20μL(补足到总体积20μL)

2. 轻轻混匀

如用Oligo(dT)或基因特异引物(GSP),50℃孵育30-50 min(如产物用于qPCR,50℃孵育15 min)。

如用Random Primer,25℃孵育10 min,50℃孵育30-50 min(如产物用于qPCR,50℃孵育15 min)。

注意:本制品在42℃-60℃反转录均有稳定良好效果。如果模板具有复杂二级结构或高GC区域,可尝试将反应温度提高至55℃-60℃,有助于提高产量。

3. 85℃加热5 sec失活HotScript Hˉ RTase。

4. 得到的cDNA产物可立即用于PCR反应,或在-20℃保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-70℃保存。cDNA应避免反复冻融。

RT-PCR:建议取1/10-1/5体积(2-4μL)的反转录产物作为PCR模板。丰度高的可以酌情适当稀释cDNA后使用。

建议PCR条件:请按照选择的爱普科学PCR试剂或者其它厂家PCR试剂说明书进行。

建议爱普科学配套PCR试剂:

1. 常规扩增:GP127-AipMix 2× Taq PCR MasterMix(+Dye)

                     GP124-AipMix 2× F8 FastLong PCR MasterMix(+Dye)

2. 高保真扩增:GP111-AipMix 2× A8 FastHiFi PCR MasterMix(+Dye)

                        GP112-AipMix 2× A9 LongHiFi PCR MasterMix(+Dye)

注意事项:

1. 避免RNase污染。

2. 为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。

3. 可选步骤(一般不需要):如果RNA模板GC含量丰富或者有复杂二级结构、或者扩增cDNA长度超过3kb,可以先只加RNA模板、引物和和RNase free Water混匀,65℃变性5分钟,冰上冷却,短暂离心后加入其它成分继续下面的反转录步骤。

4. 5× HotScript Reaction Mix非常粘稠,溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失,用前请点甩离心后使用,并且避免吸头外壁沾附损失。5× HotScript Reaction Mix内包含的酶均为过量,即使每次按照3.6μL-3.8μL使用,也不影响使用效果。

 

FP301使用说明书:

包 装 量:

目录编号

包装单位

产品规格

FP301-01

1.25mL

125次*20uL

产品储存:-20℃避光保存,有效期24个月;使用前充分融解混匀;短期使用可放在4℃,避免反复冻融。

制品说明:

    本制品本制品是采用SYBR® Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。已经将热启动HotMaster Taq DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液、BSA和SYBR® Green I等试剂预混成一种适合Real Time PCR反应检测用2× Premix Type试剂,具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板和引物和水,便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对目的基因进行准确定量检测,重复性好,可信度高。

    本品采用全新的Hotmaster Taq DNA聚合酶,该酶不同于一般Hot-start酶之处在于,一般的Hot-start酶只在第一步温度升高之前封闭酶的活性,而Hotmaster Taq DNA聚合酶是利用抑制剂通过温度调节方式封闭Hotmaster Taq DNA聚合酶的底物结合位点,温度低于40℃时,形成非活性的酶-抑制剂复合物,当温度升高至引物特异性的退火温度时,结合平衡向模板-特异性引物复合物形成方向移动,因此最大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生,大大提高了荧光定量PCR反应的精确性。

注意事项:

1. 本制品不含参比染料ROX,客户须根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加入ROX参比染料,用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差,配套参比染料为:ROX Reference Dye(100×)(货号:FP307)。

2. 本制品含SYBR® Green I 强光下易分解,降低敏感度,使用时避免长时间强光照射本制品。

3. 建议在冰上配制PCR反应液,再放入PCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性,减少背景。

4. 本制品含有4mM MgCl2(反应体系终浓度是2mM Mg2+),可用25mM MgCl2 优化Mg2+浓度。

建议PCR条件:(以25μL和50μL反应体系为例,反应液配制请在冰上进行)

Components

Volume(25μL)

Volume(50μL)

Final Concentration

2× SYBR qPCR Mix

12.5μL

25μL

DNA Template

1μL

2μL

as required

Forward Primer (10μM)

0.5μL

1μL

0.2μM each

Reverse Primer (10μM)

0.5μL

1μL

0.2μM each

ddH2O to final volume

25μL

50μL

Not applicable

HotScript SYBR Green Two-Step qRT-PCR Kit(图1)

说明:本制品兼容性强,适用于不同厂家、型号的荧光定量PCR仪,绝大多数情况下使用二步法和三步法均可获得良好效果。在实际使用中可以根据机型推荐和具体情况对程序加以微调。一般来说,二步法扩增特异性高,三步法扩增效率高。如果融链曲线较差,可以尝试两步法扩增;若因使用Tm值较低的引物等原因,得不到良好的实验结果时,可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。

荧光定量PCR实验常见问题和解决方案:

A1:无信号值出现

Q1:

1. 反应循环数不够。一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45cycles),但高于45个循环会增加过多的背景信号。

2. 检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

3. 引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。

4. 引物或探针的设计,如探针高于引物的温度不够,造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。

5. 模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

6. 模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

A2:CT值出现过晚

Q2:

1. 扩增效率低,反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。

2. PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

3. PCR产物太长。一般采用100-150bp的产物长度,一般不超过500bp。

A3:标准曲线的线性关系不佳

Q3:

1. 加样存在误差,使得标准品不呈梯度。

2. 标准品出现降解。应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。

3. 引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。

4. 模板中存在抑制物,或模板浓度过高。

典型扩增曲线和融链曲线图(使用本制品在Roche Light Cycler 480 II 三步法操作实际图片)

HotScript SYBR Green Two-Step qRT-PCR Kit(图2)

品牌: 爱普科学
产品别名: 两步法荧光定量耐热反转录PCR试剂盒
规格: 50次*20uL/125次*20uL/100次*20uL/125次*20uL
性状: 液体
储存温度: -20℃
保质期: 12个月
产品说明: 热销爆款!
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