产品储存：－20℃储存，至少12个月内不影响使用效果。

产品介绍：

    本制品采用了世界最先进的Directional Topoisomerase Cloning(定向拓扑异构酶克隆技术)可以在5分钟内将待表达目的基因(高保真酶扩增的平末端片段)一步法定向克隆到Gateway入门载体(Entry vector)，得到的入门克隆(Entry clone)可以和各种Gateway目的载体(Destination vector)通过LR重组反应，生成表达克隆(Expression clone)。方便目的基因在原核/哺乳动物细胞/酵母/昆虫表达系统切换表达。

1. 简单快速，加入待表达基因片段室温仅需5分钟便可完成入门克隆构建。

2. 定向克隆技术，超过90%插入为正确方向插入，减少克隆筛选耗费的时间。

3. 本载体不含原核表达Shine-Dalgarno(SD)序列，因此构建原核表达克隆时应选择带SD序列的目的载体进行LR重组。也可在设计的时候，在目的片段前自带SD序列。

    测序可以采用M13F/M13R通用引物测序(见后面图谱)

操作步骤：

1. 待表达目的基因扩增引物设计原则：

1) 为了达到定向克隆的目的，上游引物5’端应该加上额外的4个碱基CACC，这样PCR产物的5’端可以和载体上突出的GTGG互补配对，从而达到定向克隆的目的。

举例：

待表达序列：5′-ATG GGA TCT GAT AAA ...

设计上游引物：5′-CACC ATG GGA TCT GAT AAA ...

2) 如果不计划和载体C端融合表达，则下游引物的起始端应该加上终止密码子(密码子序列应该为反向互补序列，例如终止密码子是TGA，那么下游引物起始为TCA)

3) 如计划和载体C端融合表达，则下游引物的起始端应该不包含终止密码子；为达到定向克隆的目的，下游引物5' 起始应该不包含CACC，这样可以避免PCR产物的3' 端也可以和载体上突出的GTGG互补配对而造成错误方向的插入。

2. 连接反应的准备：

PCR引物不能磷酸化。使用扩增产物是平末端的高保真聚合酶系列扩增(如Pfu、Vent、Kod、Phusion DNA Polymerase)。PCR产物建议琼脂糖凝胶DNA纯化回收(货号：DR201)。

3. 连接反应：

1) 室温(20℃-30℃)按照如下体系操作(10μL体系)：

加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底，注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温(20℃-30℃)进行。

不同大小插入片段的推荐用量：

2) 室温(20℃-30℃)连接5分钟。

注：本载体推荐室温5分钟完成连接，但在很多情况下连接2-3分钟已经可以得到足够多的转化子。

3) 连接产物可直接转化克隆感受态细胞(如DH5a，TOP10等)或贮存于-20℃。

注：如尚未准备好感受态细胞，可以将连接产物短时间置于冰上备用。

4. 转化：

1) 50-100μL感受态细胞，置于室温解冻，完全解冻后(约1分钟左右)轻掸几次将细胞均匀悬浮。

2) 加入5μL连接液(最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的1/10)，轻轻混匀，室温放置5分钟。

注：根据我们的经验，本公司载体使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5分钟便可获得足够多转化子，如果实验室自制感受态细胞或者效率较低时，可以按照标准程序进行。

3) 加300-500μL LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃ 180rpm振荡培养60分钟。

注：根据我们的经验，一般可以直接将培养基(事先平衡至室温)加入感受态细胞的1.5mL离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可，不需要转移到试管培养复苏。

4) 取200μL菌液涂板，培养过夜(如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000rpm 离心1 min，吸弃掉部分上清，保留100-150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板)

5. 转化子的筛选鉴定：

1) 菌落PCR检测/提取质粒内切酶酶切鉴定阳性克隆。

2) 用M13通用引物测序，来确定是否含有目的克隆。

pTOPO-ENTR/D载体图谱：

pTOPO-ENTR/D载体通用测序引物序列：

  M13F：CTGTAAAACGACGGCCAG

  M13R：CAGGAAACAGCTATGAC

pTOPO-ENTR/D载体克隆位点序列：

产品说明书.pdf