产品储存：－20℃保存，有效期12个月。由于试剂盒中提供的反应缓冲液及dNTP等成份是为反应专门优化的超纯dNTP，所以不要用其它的反应缓冲液及dNTP等代替。

制品说明：本定点突变试剂盒是基于PCR原理向目的DNA片段(一般为质粒)中引入碱基的点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)等。一般宿主菌培养扩增的质粒DNA是甲基化的，PCR扩增新合成的DNA是非甲基化的。首先以待突变的甲基化质粒为模板，利用快速超高保真的SuperPfu聚合酶实现突变质粒的合成(非甲基化，包含突变点，且有两个缺刻点nick点)，再利用Dpn I酶选择性降解甲基化的模板质粒，剩下的新合成非甲基化的突变质粒转入大肠杆菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。一般可以产生大于90%的突变效率。

适用范围：< 12kb甲基化质粒中核苷酸的突变。

产品特点：

1. 简单方便，一个PCR管中完成所有操作，速度最快。

2. 采用部分重叠引物设计，使PCR呈指数扩增，扩增产物凝胶电泳可见增加成功率。

3. 效率高，使用Dpn I去除非突变模板，突变效率高达90%；不需要使用特殊感受态细胞降解非突变质粒。

4. 采用分子进化改造的SuperPfu可以提供4倍-6倍于pfu的扩增速率提高和3倍于pfu的超高保真性。

引物设计：

1. 引物包含5'端重叠区和3'端延伸区。5'端重叠区长度大约18-20bp，3'端延伸区长度大约是10-12bp。

2. 突变位点设计在5'端重叠区的中间位置，突变位点的左侧5'端大约7-9bp，右侧3'端20-22bp。

3. 引物应该选择PAGE或者更高的纯化方式，3'端为一个或者更多个G/C结尾。

4. 举例：氨基酸V(GTA)连续突变3个碱基成为R(CGT)

建议PCR条件(25μL反应体系) ：

PCR循环：

注意：一般选择2kb/min扩增，但是扩增时间通常可以在1kb/20-40秒范围内调整。

注意：在保证扩增成功的基础上，待突变质粒模板用量越少，DpnI消化越充分，突变阳性率越高。

电泳检测：取5μL PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。如能看见目的条带(或者见到目的条带外还有其它条带)，则可预判基本成功；

注意：即使未见条带，也可以继续进行后续步骤，但是成功几率大大降低。

PCR产物的消化：直接加0.5μL Dpn I酶于PCR产物中(约20μL)，充分混匀，继续PCR仪器上37℃孵育1小时(不用热盖)。

注意：Dpn I含甘油，易沉底，一定要吹打混匀。如果非突变质粒较多，可以延长消化时间到3-5小时。

转化：加入5-10μL Dpn I酶消化产物于50μL-100μL感受态细胞中(效率≥10的8次方)，轻弹混匀，冰浴30分钟。按照标准转化步骤转化，最后将菌液铺板，培养过夜(为得到较多的克隆，4000rpm 离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜)。

注意：应该选择效率高的感受态细胞，如无克隆生长，或克隆数少，可以将20μL消化产物全部转入200μL感受态细胞中，或者把Dpn I酶消化后的产物用常规的乙醇沉淀浓缩，这样就可以把所有的产物全部用于转化。

产品说明书.pdf