储存条件：本试剂盒按照指示储存12个月不影响使用效果。

储存注意事项：

1. 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

2. 不合适的储存于低温(4℃或者－20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下(15℃－25℃)进行。

3. Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液，因此比较粘稠，请小心取用，－20℃保存。蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。

4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：酵母细胞经Lytic Enzyme处理去除细胞壁后，独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-free Water将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点：

1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2. 不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

3. 快速简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。

4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot等各种实验。

注意事项：

1. 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入！

2. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm 的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。

3. 需要自备乙醇，β-巯基乙醇，水浴锅。

4. 裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5. 关于DNA的微量残留：一般情况下，一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本公司的EASYspin系列RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留(一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

1) 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。

2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。

3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(Clean up)，请联系我们索取具体操作说明书。

4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。

6. RNA纯度及浓度检测：

完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%，0.5× TBE电泳缓冲液，150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀读数(10mM Tris，pH7.5)在1.9-2.2之间。OD₂₆₀/OD₂₈₀读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD₂₆₀/ OD₂₈₀读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-Free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD₂₆₀和OD₂₈₀测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度(ng/μL)=(OD₂₆₀)×(稀释倍数n)×40。

操作步骤(实验前请先阅读注意事项)：

提示：第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量无水乙醇！操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1mL RLT中加入10μL β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。吸取使用量的缓冲液SE加入0.2%β-巯基乙醇备用。

1. 小量酵母培养细胞

1) 收集1mL(约10⁷细胞)处于对数生长期酵母培养物到1.5mL离心管，12,000rpm 离心30秒，尽可能吸弃上清。

2) 加入100μL缓冲液SE中(确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度0.2%)，轻柔吹打充分重悬细胞；根据酵母量加入约20μL Lytic Enzyme储液，充分颠倒混匀，37℃温育15－30分钟消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。

注：如果破壁效果不好导致产量低，可以加大Lytic Enzyme用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果，不适合Lytic Enzyme消化的酵母可选用其它方法如0.5mm玻璃珠涡旋击打，反复冻融等。

3) 加入380μL裂解液RLT(确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度1%)，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。

注：一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物，极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13,000rpm 离心3分钟，沉淀不能裂解的碎片或者不溶物，将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。

4) 加入280μL 96－100％乙醇，立即吹打混匀，不要离心。

5) 接操作步骤项下3。

2. 中量酵母培养细胞

1) 收集2－3mL(约3X10⁷细胞)处于对数生长期酵母培养物到1.5mL离心管(超过1.5mL可分两次在同一个离心管内进行收集细胞)，12,000rpm离心30秒，尽可能吸弃上清。

2) 加入300μL缓冲液SE中(确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度0.2%)，轻柔吹打充分重悬细胞；根据酵母量加入50μL Lytic Enzyme储液，充分颠倒混匀，37℃温育15－30分钟消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。

注：如果破壁效果不好导致产量低，可以加大Lytic Enzyme用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果，不适合Lytic Enzyme消化的酵母可选用其它方法如0.5mm玻璃珠涡旋击打，反复冻融等。

3) 13,000rpm 离心1分钟，尽可能吸弃上清。

4) 加入350μL裂解液RLT(确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度1%)，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。

注：一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物，极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13,000rpm 离心3分钟，沉淀不能裂解的碎片或者不溶物，将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。

5) 加入等体积70％乙醇(DEPC水配制，约350μL)立即吹打混匀，不要离心。

6) 接操作步骤项下3。

3. 将混合物加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm 离心30-60秒，弃掉废液。

4. 加700μL去蛋白液RW1，室温放置30秒，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

注：如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。

5. 加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。

6. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm 离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

7. 取出吸附柱RA，放入一个RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μL RNase-free Water(事先在70-90℃水浴中加热可提高产量)，室温放置1分钟，12,000rpm 离心1分钟。

8. 如果预期RNA产量>30μg，加30-50μL RNase-free Water重复步骤7，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。

注：洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15-30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。

产品说明书.pdf