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适用范围:适用于大规模高纯度酵母质粒制备。
产品储存:本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:
1. 第一次使用时,将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液YP1(终浓度100µg/mL)置于4℃保存。如果溶液YP1中RNase A失活,提取的质粒可能会有微量RNA残留,在溶液YP1中补加RNase A即可。
2. 环境温度低时溶液YP2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍:
本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞,并结合破壁酶特异消化酵母细胞壁,能在1小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除细胞壁后,然后碱裂法裂解细胞,离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
本试剂盒提取的质粒纯度很高,并去除了大部分内毒素,除用于常规的PCR、酶切、转化等实验外,还可以直接用于原生质体转染等一般的转染实验。
产品特点:
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好,克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。
3. 快速方便,获得的质粒产量高、纯度好,可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
注意事项:
1. 所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成,使用转速可以达到至少6,000xg,带50mL转头的台式离心机。
2. 溶液YP3和去蛋白液PD中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
3. 通常酵母质粒拷贝数都很低,高拷贝质粒最大得率一般为每5mL培养物提取1μg左右的质粒。用于下游试验时通常建议使用量为:1-5μL用做PCR模板;5-10μL用于转化大肠杆菌,选择高效率的感受态细胞。
4. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/mL DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
5. 用户需要自备Sorbitol Buffer(1M 山梨醇,0.1M Na2EDTA,14mM β-巯基乙醇)。配制方法:在600mL去离子水里面溶解182.2克山梨醇,加入200mL 0.5M Na2EDTA(pH 8.0),不需要调节PH值,定容到1L,4℃保存。临用前加0.1%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)。
6. 菌体浓度检测一般OD600值为1的时候,酿酒酵母细胞是1-2x107 cells/mL,由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大,以上仅供参考。
7. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保批pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
操作步骤(实验前请先阅读注意事项):
提示:第一次使用前请先在漂洗液WB和去蛋白液PE瓶中按照该组分标签上的指示,加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!将RNase A全部加入溶液P1中,混匀。每次使用后置于2-8℃保存。将溶液P3放在冰上预冷。吸取使用量的Sorbitol Buffer加入0.1% β-巯基乙醇,回复到室温备用。
1. 取约100-180毫升酵母培养物,6000xg,离心10分钟,尽可能的倒干上清,收集菌体。
注:收集超过50毫升菌液,可以离心弃上清后,在同一个50mL管内加入更多的菌液,重复步骤1,直到收集到足够的菌体。
2. 加入10mL Sorbitol Buffer,轻柔吹打充分重悬细胞;加入0.1g 破壁酶(破壁酶临用前用2mL Sorbitol Buffer溶解),充分颠倒混匀,37℃温育1-2小时消化细胞壁,中间可颠倒数次帮助消化。
注:如果破壁效果不好导致质粒产量过低,可以加大破壁酶用量来提高酶工作浓度,还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果,不适合破壁消化的酵母可选用Lyticase或者Zymolase或者其它方法如加玻璃珠涡旋振荡,反复冻融等。
3. 离心机6000xg,离心10分钟,尽可能吸弃上清,加入7mL溶液YP1重悬菌体沉淀,涡旋振荡至彻底悬浮。
注:如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
4. 加7mL的溶液YP2,温和地上下翻转4-7次使菌体充分裂解,室温放置4分钟。
注:温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时间不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。
5. 加10mL溶液YP3,立即温和地上下翻转4-7次,充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。12,000xg离心10-15分钟,小心取上清,避免吸取到漂浮的白色沉淀。
注:加入溶液YP3后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀,如果上清中还有飘浮白色沉淀,可再次离心后取上清。
6. 可选步骤:一般不需要(4℃,12,000xg离心10-15分钟,小心取上清)。
7. 将上一步所得上清加入吸附柱DC中(每次不超过10mL,因个别情况下离心机转子倾角较大,建议加入吸附柱的溶液体积不超过10mL,以防产生漏液现象),12,000xg离心1分钟,倒掉收集管中的废液。
注:如果上清体积超过20mL,可以分多次过柱。
8. 加入10mL去蛋白液PE(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000xg离心1分钟,弃掉废液。
9. 加入10mL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000xg离心1分钟,弃掉废液。
10. 重复操作步骤9一次。
11. 将吸附柱DC放回空收集管中,最高速(最好大于12,000xg)离心2分钟以干燥基质膜上残留乙醇。
注:该步骤为彻底去除吸附柱中残留乙醇,残留乙醇抑制下游反应并且严重降低洗脱效率,降低质粒产量。
12. 取出吸附柱DC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加1mL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热可提高产量),室温放置2分钟,12,000xg离心1-2分钟。
推荐:为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置1分钟,12,000xg离心1-2分钟。洗脱两遍可提高浓度约10%。
注:洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要质粒浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于0.6mL,体积过小降低质粒洗脱效率,减少质粒产量。
品牌: | 爱普科学 |
英文名称: | AipFast Yeast Endo-Free High-Pure Rapid Plasmid Maxi Kit(Centrifugal Column) |
规格: | 10T |
性状: | 液体 |
储存温度: | RT |
保质期: | 12个月 |
产品说明: | 收到产品后,请尽快按照试剂盒内各组分的储存温度保存! |
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