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储存条件:试剂盒内各组分按各自所需条件保存,冰袋运输,保质期12个月。
产品概述:本产品TSA Plus荧光双重染色试剂盒,适用于石蜡切片免疫荧光双重染色,尤其适用于相同来源一抗的双重荧光免疫标记,也可用于不同来源抗体的双重荧光免疫标记。主要原理是基于酪胺信号放大(TSA,Tyramide signal amplification),以下简称TSA技术。TSA技术主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(即荧光标记的酪胺盐在HRP催化H2O2下形成共价键结合位点),产生大量的酶促反应,该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基)结合,在抗原-抗体结合部位形成大量的荧光素沉积,实现信号放大。还可以通过多次重复免疫标记,使用不同的荧光酪胺实现多重荧光染色。相较于本公司另一款TSA荧光双重染色试剂盒(货号:M398),本试剂盒分别用荧光信号更强更稳定的iF488-Tyramide、iF555-Tyramide代替了FITC-Tyramide和CY3-Tyramide,是货号:M398的升级版。
TSA系列荧光染色试剂盒相关荧光染料的荧光光谱数据如下:
荧光染料类型 | Ex/Em |
FITC-Tyramide | 492/518 |
CY3-Tyramide | 555/569 |
iF488-Tyramide | 491/516 |
iF555-Tyramide | 557/570 |
iF647-Tyramide | 656/670 |
实验前准备:
1. 自备0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0-7.4,可购买C511或C513),3% H2O2和0.3% H2O2。
2. 自备一抗及相应HRP标记二抗,抗原修复液(根据抗体及组织类型选择合适的抗原修复液)。
3. 根据用量,按照下表比例配制TSA染色工作液。
TSA染色工作液 | 试剂名称 | 体积 |
TSA-488染色工作液 | Tyramide稀释液 | 1 mL |
0.3% H2O2 | 10 μL | |
iF488-Tyramide | 2 μL | |
TSA-555染色工作液 | Tyramide稀释液 | 1 mL |
0.3% H2O2 | 10 μL | |
iF555-Tyramide | 2 μL |
注:荧光Tyramide融化后离心机短时离心,干净吸头吹吸混匀后取用。TSA染色工作液建议现配现用,需4℃避光保存,24h内有效。
操作步骤:(以组织切片为例,以下实验步骤中的实验用水均为纯水)
1. 组织切片脱蜡至水。
2. 抗原修复:根据所使用的一抗及样本类型,采用合适方式对组织切片进行抗原修复。
3. PBS清洗3次,每次5 min,然后用免疫组化笔对组织画圈标记。
4. 灭活内源性过氧化物酶:向切片上滴加3% H2O2覆盖组织,室温避光孵育25 min,阻断内源性过氧化物酶,以减少非特异性背景染色。PBS清洗3次,每次5 min。
5. 封闭:切片水分稍微甩干后,向组织上滴加3% BSA或血清封闭30 min,具体根据一抗及二抗种属决定封闭试剂。
6. 一抗孵育:用PBS(或其他抗体稀释液)将一抗稀释至适当浓度。轻轻甩掉切片上的液体,滴加稀释好的一抗覆盖组织,切片平放于加水的湿盒内4℃孵育过夜。PBS清洗3次,每次5 min。
7. 对应HRP二抗孵育:用PBS(或其他抗体稀释液)将二抗稀释至适当浓度,向组织上滴加二抗,室温孵育50 min。PBS清洗3次,每次5 min。
8. 向组织上滴加50-100μL TSA-488染色工作液确保完全覆盖组织,室温避光孵育10 min。PBS清洗3次,每次5 min。
9. 微波处理:组织切片置于盛满抗原修复液(根据组织类型及抗体选择合适的抗原修复液)的修复盒中进行微波加热处理,去除已经结合的一抗二抗。(微波建议的时间和温度:加热到95℃以上,维持15 min)此步骤中需防止液体过度蒸发导致的干片。
10. 重复步骤6,进行第二个一抗的孵育:用PBS(或其他抗体稀释液)将需检测的第二个抗体(一抗)稀释至适当浓度。轻轻甩掉切片上的液体,滴加稀释好的抗体覆盖组织,切片平放于加水的湿盒内4℃孵育过夜。PBS清洗3次,每次5 min。
11. 重复步骤7,进行对应HRP二抗孵育:用PBS(或其他抗体稀释液)将二抗稀释至适当浓度,向组织上滴加二抗,室温孵育50 min。PBS清洗3次,每次5 min。
12. 向组织上滴加50-100μL TSA-555染色工作液确保完全覆盖组织,室温避光孵育10 min。PBS清洗3次,每次5 min。
13. 细胞核复染DAPI:切片稍甩干后在组织上滴加DAPI(即用型)染色液,避光室温孵育10 min。PBS清洗3次,每次5 min。
14. 组织自发荧光淬灭(可选):向组织上滴加组织自发荧光淬灭剂(苏丹黑),室温孵育5 min,流水冲洗3 min。
15. 封片及镜检:切片稍甩干后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并采集图像。切片置于避光切片盒内4℃可保存15天。
注意事项:
1. 与荧光二抗相比,TSA试剂盒有更高的灵敏度和更强的信号。因此一抗使用浓度需降低,一般在抗体说明书建议的稀释比基础上再扩大5-10倍,以减少非特异性结合导致的背景荧光。建议设置一抗梯度浓度获得最佳效果。
2. 如背景荧光较强,建议增加组织自发荧光淬灭步骤。
3. 荧光Tyramide的建议稀释比是1:500,可根据实验结果调整稀释比例(调整范围1:200 - 1:1000)。
4. 如进行多重荧光标记,建议先孵育多抗,后孵育单抗;先孵育低丰度目的蛋白对应的抗体,再孵育高丰度目的蛋白对应的抗体。
5. 为了您的健康和安全,操作时请穿好实验服、戴好手套。
6. 本产品仅供科研使用,不得用于临床和诊断。
品牌: | 爱普科学 |
产品别名: | TSA Plus Fluorescent Double Staining Kit |
规格: | 50T/100T |
性状: | 液体 |
储存温度: | 2-8℃/-20℃ |
保质期: | 12个月 |
产品说明: | 收到产品后,请尽快按照试剂盒内各组分的储存温度保存! |
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