适用范围：适用于从无细胞体液(血浆、血清、腹水、培养细胞上清液、脑脊髓液及尿液等)中快速提取高纯的病毒DNA/RNA。

产品储存：本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

产品介绍：

    本试剂盒采用采用特异性结合病毒RNA的独特的缓冲液系统和特制离心吸附柱，适合于从无细胞体液(包括血浆、血清、腹水、培养细胞上清液、脑脊髓液及尿液等)中快速提取高纯的病毒RNA。该产品可以满足绝大多数的病毒RNA的提取要求，如病毒RNA：HCV(丙肝病毒)、HIV(艾滋病毒)和HTLV(人类嗜T淋巴细胞病毒)等等。

    本试剂盒配备了爱普科学独家研发的特制裂解液，病毒被裂解后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜上，再通过一系列快速的漂洗/离心等步骤，将盐、细胞代谢物和蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净的病毒RNA从硅基质膜上洗脱。纯化后的病毒RNA无杂质和抑制剂，纯度高、完整性好，可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR和Northern-Blot等下游相关分子生物学实验。

产品特点：

1. 操作安全，完全不使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2. 节省时间，快速简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。

3. 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达2.1-2.2(100%纯的RNA比值一般是2.2左右)，提取的病毒RNA纯度高、完整性好，质量稳定可靠，可适用于各种常规操作，包括反转录PCR、荧光定量PCR和Northern-Blot等相关试验。

注意事项：

1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

3. 裂解液RLB和去蛋白液RE中含有刺激性化合物，操作时请穿实验服并佩戴一次性乳胶手套，实验操作中应避免避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或者生理盐水冲洗。

4. 预防RNase污染，应注意以下几方面：

1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2) 使用RNase-free的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3) RNA在裂解液中时不会被RNase降解，但提取后继续处理过程中应使用RNase-free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4) 配制溶液应使用RNase-free的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌)

5. 关于DNA的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留(DNase消化也无法做到100%无残留)，本公司的RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和特殊吸附能力的吸附膜，已经清除了绝大部分的DNA残留，在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留(一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

1) 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。或者选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。或者缩短延伸时间，使DNA来源模板无法参与扩增反应。

2) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁纯化(货号：RE282)，请联系我们索取具体操作说明书。

3) 在操作步骤的去蛋白液RE漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I柱上消化处理，以进一步清除gDNA残留污染。可购买爱普科学的DNA酶柱上消化试剂盒(货号：RE280)，购买前可先索取具体操作说明书。

6. RNA纯度及浓度检测：

完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%，0.5× TBE电泳缓冲液，150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为2kb和1kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则提示RNA样品的降解。出现小的弥散片状或条带消失表明样品严重降解。但是应该注意区分是提取出来的RNA样品本身降解了，还是提取出来的RNA是完好的，只是在电泳过程中降解的。

纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的重要参考指标。高质量RNA的OD260/OD280读数在2.1-2.2之间(100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司的产品因为残留蛋白或者DNA较多，造成比值降低，无法达到2.2这个纯度标准，因此降低要求1.9-2.0就凑合使用了，但是爱普科学的试剂盒提取产品标准一般可以达到高水准的2.1-2.2的纯度标准)。OD260/OD280读数受测量使用的机器影响，也受测定所用稀释溶液的pH值影响。微量分光光度计一般不需要稀释，不受稀释溶液的PH值影响。但是同一个RNA样品，如果测量的时候机器要求稀释后测量，假定在10mM Tris，pH7.5稀释溶液中测出的OD260/OD280读数1.9-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260和OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度(ng/μL)=(OD260)×(稀释倍数n)×40。

操作步骤(实验前请先阅读注意事项)：

提示：第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中按照该组分标签上的指示，加入指定量无水乙醇，充分混匀后请及时在标签上标记已加入乙醇，以免多次加入！

1. 取200μL血清等样本体液(需恢复到室温，不足可用0.9% NaCl或者PBS补足)转入一个新的1.5mL离心管，加入400μL裂解液RLB，立刻涡旋振荡充分混匀。

2. 室温(15-25℃)放置10分钟，每隔5分钟，振荡混匀一次。

3. 加入450μL无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀。

注：如果周围环境高于25℃，乙醇需要冰上预冷后再加入。

4. 将上述混合物加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)12,000rpm离心30-60秒，弃废液。

注：如果总体积超过750μL，可分两次将混合物加入同一个吸附柱RA中。

5. 加入500μL去蛋白液RE，12,000rpm离心30秒，弃废液。

6. 加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000rpm 离心30秒，弃废液，再加入500μL漂洗液RW，重复操作一遍，弃废液。

7. 将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

8. 取出吸附柱RA，放入一个新的无酶的1.5mL离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加入30-50μL RNase-free Water(事先在65－70℃水浴中加热效果更好)，室温放置1分钟，12,000rpm 离心1分钟。如果想得到较多量的RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，12,000rpm离心1分钟，洗脱RNA。提取的高纯度RNA可直接用于下游相关实验或储存于-85℃至-65℃保存。

注：可重新加入30-50μL RNase-free Water重复操作步骤8一遍，合并两次洗脱液(如果需要RNA产量高)；或者使用第一次的洗脱液重新加回到吸附柱内，重新洗脱一遍(如果需要RNA浓度高)。用户根据具体实验需要自行选择。

注：洗脱体积越大，洗脱效率越高，RNA产量越高，但是浓度将会降低。如果需要RNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小洗脱体积建议最好不少于20μL，体积过小会降低RNA洗脱效率，减少RNA产量。

产品说明书.pdf