适用范围：适用于快速从同一个细菌样本中同时分离提取基因组DNA和总RNA。

产品储存：本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。常温组分储存于低温(4℃或-20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下(15-25℃)进行。

产品介绍：

    本试剂盒适用于快速从同一个细菌样本中同时分离提取基因组DNA和总RNA。采用爱普科学独特的裂解液，可迅速裂解细胞和灭活细胞RNA/DNA酶，然后裂解混合物DNA/RNA同时通过一个基因组DNA吸附柱，基因组DNA被吸附而RNA穿透滤过。DNA吸附柱上的基因组DNA经过一系列漂洗/离心等步骤，洗脱得到纯净基因组DNA。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于RNA吸附柱上，再通过一系列快速的漂洗/离心等步骤，洗脱得到纯净的RNA。

    本试剂盒在爱普科学独家推出的无苯酚、氯仿DNA/RNA快速提取技术基础上，又配合爱普科学独特的分离纯化技术，同时得到的基因组DNA和RNA纯度高、完整性好、且互不干扰。得到的高纯度基因组DNA和RNA可直接用于PCR、反转录PCR、荧光定量PCR、Southern、Northern-Blot、酶切、测序等相关分子生物学实验。

产品特点：

1. 操作安全，完全不使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2. 快速简捷，单个样品基因组DNA/ RNA分离提取操作一般可在50分钟内完成。

3. 爱普科学独家研发的基因组DNA清除柱技术确保高效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。

4. 多次柱漂洗确保高纯度，得到的基因组DNA/RNA纯度高、完整性好。

注意事项：

1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

3. 样品处理量绝对不要超过基因组DNA吸附柱和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时，宁可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。

4. 裂解液RLT Plus、抑制物去除液IR、去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时请穿实验服并佩戴一次性乳胶手套，实验操作中应避免避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或者生理盐水冲洗。

5. 预防RNase污染，应注意以下几方面：

1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2) 使用RNase-free的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3) RNA在裂解液中时不会被RNase降解，但提取后继续处理过程中应使用RNase-free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4) 配制溶液应使用RNase-free的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌)

6. 关于DNA的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留(DNase消化也无法做到100%无残留)，本公司的RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和特殊吸附能力的吸附膜，已经清除了绝大部分的DNA残留，在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留(一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

1) 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。或者选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。或者缩短延伸时间，使DNA来源模板无法参与扩增反应。

2) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁纯化(货号：RE182)，请联系我们索取具体操作说明书。

3) 在操作步骤的去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I柱上消化处理，以进一步清除gDNA残留污染。可购买爱普科学的DNA酶柱上消化试剂盒(货号：RE180)，购买前可先索取具体操作说明书。

7. RNA纯度及浓度检测：

完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%，0.5× TBE电泳缓冲液，150v，15分钟)检测完整性。由于细菌中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。细菌rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于26S和13S rRNA。细菌RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。但是应该注意区分是提取出来的RNA样品本身降解了，还是提取出来的RNA是完好的，只是在电泳过程中降解的。

纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白质污染程度的重要参考指标。高质量RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀读数在2.1-2.2之间(100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司的产品因为残留蛋白或者DNA较多，造成比值降低，无法达到2.2这个纯度标准，因此降低要求1.9-2.0就凑合使用了，但是爱普科学的试剂盒提取产品标准一般可以达到高水准的2.1-2.2的纯度标准)。OD₂₆₀/OD₂₈₀读数受测量使用的机器影响，也受测定所用稀释溶液的pH值影响。微量分光光度计一般不需要稀释，不受稀释溶液的PH值影响。但是同一个RNA样品，如果测量的时候机器要求稀释后测量，假定在10mM Tris，pH7.5稀释溶液中测出的OD₂₆₀/OD₂₈₀读数在1.9-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD₂₆₀和OD₂₈₀测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度(ng/μL)=(OD₂₆₀)×(稀释倍数n)×40。

操作步骤(实验前请先阅读注意事项)：

提示：第一次使用前请先在漂洗液RW瓶、漂洗液WB和70%乙醇瓶中按照该组分标签上的指示，加入指定量无水乙醇，充分混匀后请及时在标签上标记，以免多次加入！提取细菌样本RNA需先配制已加入溶菌酶(Lysostaphin)的TE/酶工作液，确定TE溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA)中已加入溶菌酶(Lysostaphin)，浓度为1mg/mL，备用。

1. 离心收集1-2mL菌液(108-109细胞)到一个1.5mL离心管，尽可能去除上清，注意残留的上清不能超过20μL/每使用100μL TE/酶工作液。

2. 根据细胞的种类和数量，充分重悬细胞在100uL(5x108细胞)或200uL(5x108-7.5x108细胞)的TE/酶工作液中。

注：也可以直接用TE溶液重悬后，用干净枪头挑取少许溶菌酶加入。

3. 室温(15-25℃)温育5分钟(溶菌酶)，或者37℃温育15分钟(Lysostaphin)，破解细胞壁。每2分钟涡旋振荡10秒帮助破壁。

注：各种细菌破壁的难易程度不一样，一般革兰氏阴性菌E.coli使用上面的条件就足够了，甚至可能省略该步骤。但是某些革兰氏阳性菌如B.subtilis难破壁需要提高溶菌酶浓度到15mg/mL和温育时间到10分钟。如果金黄色葡萄球菌需要加入Lysostaphin到1mg/mL，37℃温育15分钟。总之不同细菌类型破壁难易程度不同，有的难破壁的种类需要根据用户自己的具体情况调节酶的种类、工作浓度、温育温度和时间，此外还可以联合使用玻璃珠击打、机械破壁、蛋白酶K消化等方法帮助破壁。

4. 短暂离心收集细胞到管底，吸弃上清后，涡旋振荡重悬分散细胞。

5. 加入500μL裂解液RLT Plus，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。

注：一般加入裂解液后充分涡旋吹打后，应该见不到明显团块或者不溶物，极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13,000rpm 离心3分钟，沉淀不能裂解的碎片或者不溶物，将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。

6. 立刻将裂解物加入一个基因组DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)，13,000rpm 离心30秒，保留滤过液(RNA在滤过液中)。DNA吸附柱子(膜上吸附有基因组DNA)短时间可存放4℃度备用。

注：确保离心后液体全部滤过，膜上无残留，如有必要，可加大离心力和离心时间。

以下步骤为提取RNA步骤：

7. 用微量移液器较精确估计滤过液体积(通常为500μL，滤过时损失的体积应该减去)，加入等体积的70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

8. 立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm 离心30秒，弃废液。

9. 加入700μL去蛋白液RW1，室温放置30秒，13,000rpm 离心30秒，弃废液。

10. 加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!)，13,000rpm 离心30秒，弃废液。再加入500μL漂洗液RW，重复操作一遍，弃废液。

11. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm 离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

12. 取出吸附柱RA，放入一个新的无酶的1.5mL离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加入30-50μL RNase-free Water(事先在70-90℃水浴中加热可提高产量)，室温放置1分钟，13,000rpm 离心1分钟，洗脱RNA。提取的高纯度RNA可直接用于下游相关实验或储存于-85℃至-65℃保存。

注：如果预期RNA产量>30μg，可重新加入30-50uL RNase-free Water重复操作步骤12一遍，合并两次洗脱液(如果需要RNA产量高)；或者使用第一次的洗脱液重新加回到吸附柱内，重新洗脱一遍(如果需要RNA浓度高)。洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据具体实验需要自行选择。

注：洗脱体积越大，洗脱效率越高，RNA产量越高，但是浓度将会降低。如果需要RNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小洗脱体积建议最好不少于25uL，体积过小会降低RNA洗脱效率，减少RNA产量。

以下步骤为提取DNA步骤：

13. 在操作步骤6的DNA吸附柱上加入500μL抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。

14. 加入700μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000rpm 离心30秒，弃废液。再加入500μL漂洗液WB，重复操作一遍，弃废液。

15. 将DNA吸附柱放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

16. 取出DNA吸附柱，放入一个新的无酶的1.5mL离心管中，根据预期DNA产量在吸附膜的中间部位加入100μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好)，室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟，收集得到的DNA。DNA可以存放在-20℃，如果要长时间存放，可以放置在-70℃保存。

注：可将第一次得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，可以提高10%左右的浓度。

注：洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但最小体积不应少于50μL，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

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