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储存条件:干冰运输,-20℃避光保存,探针避免反复冻融,有效期至少6个月。
产品简介:
DiO又称DiOC18(3),中文全称3-十八烷基-2-[3-(3-十八烷基-2(3H)-苯并恶唑-2-亚基)-1-丙烯-1-基]苯并恶唑高氯酸盐,分子量881.72,是一类具有亲脂性的长链二烷基碳菁类染料荧光染料,常用于标记细胞膜以及其他脂溶性生物结构。DiO进入细胞膜后可以侧向扩散,逐渐使整个细胞膜被染色。DiO在进入细胞膜之前荧光非常弱,当与细胞结合后荧光强度会大大增强,被激发后可以发出绿色荧光,并可以用标准的FITC滤光片检测。DiO最大激发波长484nm,最大发射波长501nm。根据DiO的特性,其可以用于活细胞以及固定细胞的染色。此外DiO探针一般不影响细胞的生存能力,故可正向或逆向的标记细胞或某些物质(外泌体)用作示踪检测。
本产品DiO细胞膜绿色荧光染色试剂盒,包含DiO荧光探针及优化的染色缓冲液,使细胞膜染色更加快速、荧光更加明亮稳定、效果更好。
操作步骤:
1. DiO染色工作液配制:将DiO细胞膜绿色荧光探针与染色缓冲液以1:250比例混合稀释,配制成DiO染色工作液(现配现用)。
注意:DiO探针稀释比可根据具体情况在1:250-1:500进行调整,以获得最佳染色效果。
2. 悬浮活细胞染色:
1) 收集悬浮细胞,以500-1000xg室温离心3-5 min,去除细胞上清。
2) 使用DiO染色工作液重悬细胞,使细胞密度在1-2×106个/mL。
3) 置于37℃避光孵育5-20 min;建议根据具体细胞调整染色时间,以获得最佳染色效果。
4) 孵育结束后,500-1000xg室温离心3-5 min,吸除DiO染色工作液。
5) 用37℃预热的PBS或细胞培养基重悬细胞,500-1000xg离心3-5 min,去除上清。
6) 重复2.5步骤一次。
7) 流式细胞仪上机检测,或将细胞转移至多孔板、细胞培养皿或者载玻片上,在荧光显微镜下观察。DiO最大激发波长484nm,最大发射波长501nm。
3. 贴壁活细胞染色(6孔板为例):
1) 将细胞提前以一定密度种植于6孔板中。
2) 吸除细胞培养基,用PBS(货号:C511)洗涤细胞2次。加入1 mL DiO染色工作液(其他规格孔板,视情况调整,保证染料覆盖细胞)。
3) 置于37℃避光孵育5-20 min,吸除DiO染色工作液。建议根据具体细胞调整染色时间,以获得最佳染色效果。
4) 用37℃预热的PBS或细胞培养基,洗涤细胞1-2次。
5) 加入37℃预热的PBS或细胞培养基,荧光显微镜下观察。DiO最大激发波长484nm,最大发射波长501nm。
4. 固定的贴壁细胞染色:
1) 样本前处理:去除细胞培养基,PBS洗涤1-2次。加入4%多聚甲醛固定液(货号:M329),室温固定10 min。吸除固定液,用PBS洗涤2-3次。
2) 加入0.1-0.5% Triton-100(货号:M392或PBS配制)处理细胞,室温通透10 min;吸除通透液,用PBS洗涤2-3次。
3) (可选,免疫荧光标记)按照免疫荧光染色的方法进行抗体的孵育或其他染料进行染色。
注意:抗体孵育过程中的封闭液、抗体稀释液、洗涤液等不能含有去垢剂。
4) 加入适量体积的DiO染色工作液覆盖细胞,37℃避光孵育5-20 min,吸除DiO染色工作液。建议根据具体细胞样本调整染色时间,以获得最佳染色效果。
5) 细胞经PBS洗涤2-3次,然后置于荧光显微镜观察(细胞需以适量PBS覆盖)。DiO最大激发波长484nm,最大发射波长501nm。
5. 外泌体荧光标记:
1) 将提取的外泌体沉淀,用适量DiO染色工作液重悬。
2) 将样品置于37℃避光孵育30 min。
3) (可选)用10倍体积PBS稀释样品体积(可选)。
4) 按照之前提取获得外泌体的方案,再一次提外泌体,以去除多余的染料。
5) 收集的外泌体沉淀,用PBS重悬,得到DiO标记的外泌体。可用于相应的后续实验(例如细胞摄取等)。
注意事项:
1. 荧光染料均存在淬灭问题,请注意避光以减缓荧光猝灭。
2. 探针亲脂性的特点,实验过程中请避免使用含有甘油或其它有机物的试剂,否则会影响染色效果。
3. 当需要固定操作时,样品宜在4%多聚甲醛中(货号:M329)进行固定,其他不适当的固定液会导致荧光背景高。
4. 由于细胞间敏感性和实验目的的不同,探针的最佳稀释比和最佳孵育时间需根据实际情况适当调整。
5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
6. 本制品仅供科研使用,严禁用于临床诊断和药物等用途。
品牌: | 爱普科学 |
英文名称: | DiO Cell Membrane Green Fluorescent Staining Kit |
规格: | 100-1000T |
性状: | 液体 |
储存温度: | -20℃ |
保质期: | 12个月 |
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