胶片上有反转像(即黑色背景，白色带)

检测体系中HRP含量过高，底物消耗过快，导致过曝或空心。通常是由于样品中目的蛋白含量非常高、上样量过高、一抗或二抗用量过大、ECL类试剂的检测灵敏度过高等导致。

将HRP标记二抗稀释至少10倍

膜上有褐色条带/黄色条带或者条带出现空心

印迹在暗室中发光

信号持续时间少于8小时

信号弱或者无信号

系统中过多HRP耗尽了底物并导致信号迅速衰减

将HRP标记二抗稀释至少10倍

抗原或抗体的量不足

增加抗体或抗原的量

蛋白质转移率低

优化转印

HRP或底物活性低

为检测系统活性，暗室中，在一个清洁试管中制备1-2mL工作液。关闭灯，添加1uL未稀释的HRP标记二抗工作液。该溶液应当立即发出蓝色光，蓝色信号在随后的几分钟渐淡。

高背景

系统中HRP过多

将HRP标记二抗稀释至少10倍

封闭不充分

优化封闭条件

封闭时机不合适

尝试一种不同的封闭试剂

洗涤不充分

增加洗涤时间、次数或洗涤缓冲液体积

胶片过度曝光

缩短曝光时间或使用背景消除剂

抗原或抗体的浓度太高

减少抗体或抗原的量

蛋白质条内有斑点

蛋白质转膜效率低

优化转印流程

膜的水化不均匀

按照制造商建议适度的使膜水化

胶片与膜之间存在气泡

在胶片曝光前，去除气泡

胶片上背景有斑点

HRP标记二抗中存在聚集物

使用0.2um的过滤器

非特异性条带

系统中HRP过多

将HRP标记的二抗稀释至少10倍

SDS导致的蛋白非特异性结合

在检测过程中不使用SDS

使用ECL发光液实验无任何结果

ECL试剂是否失效

请将A液与B液等比例混合后置于一干净的离心管中，加入1微升HRP标记的二抗原液，混合均匀后可以看到蓝色荧光，如果看不到蓝色荧光说明试剂失效。