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储存条件:2-8℃运输和避光保存,12个月有效。
产品概述:
1. 细胞凋亡是发生在胚胎发育和维持组织稳态过程中的正常生理过程,伴随着许多形态学特征改变,其中细胞膜的丢失是细胞凋亡早期的特征之一。在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(Phosphotidylserine/PS)只分布在细胞膜磷脂双分子层的内侧,但在细胞凋亡早期,PS会从脂膜的内侧翻转外侧,使其暴露于细胞外侧。Annexin V(膜联蛋白V)是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,对PS具有高度亲和力,会与暴露PS的细胞特异性结合,因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的指标之一。碘化丙啶(Propidium Iodide/PI)是一种核酸染料,它不能透过具有完整细胞膜的正常细胞和早期凋亡细胞,但能透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜并将细胞核染色。
2. 本产品通过将Annexin V用IF647荧光染料分子进行标记后作为检测探针,检测细胞的早期凋亡。同时以PI区分存活的细胞与坏死、晚期凋亡细胞。Annexin V-IF647和PI结合使用,活细胞呈现阴性染色(Annexin V-/PI-),早期凋亡细胞呈现单荧光阳性(Annexin V+/PI-),而晚期凋亡细胞和坏死细胞呈现双荧光阳性(Annexin V+/PI+)。本试剂盒适用于流式细胞仪或荧光显微镜检测。
使用方法:
1. 细胞收集:
1) 悬浮细胞:取细胞悬液,经500xg,4℃离心5min收集细胞。
2) 贴壁细胞:先收集细胞培养上清液。然后用不含EDTA的胰酶(推荐C610)消化后,与细胞培养上清液合并,经500xg,4℃离心5min收集细胞。
注:胰酶消化时间不宜过长,以免过度消化引起假阳性。
2. 用预冷的PBS(推荐C511)清洗细胞2次,每次500xg、4℃离心5min收集细胞。
3. 用预冷的1×Binding Buffer轻柔重悬细胞,调整细胞浓度至1~5×106/mL。
4. 取100μL细胞悬液,加入5µL Annexin V-IF647和5µL PI,轻柔混匀,室温避光8-10min。
5. 加入400µL预冷的1×Binding Buffer,轻轻摇匀,1h内用流式细胞仪或者荧光显微镜进行检测。
结果分析:
1. 流式细胞仪检测:
1) 流式细胞仪检测分析时选择合适的电压并调好光补偿,除实验组外建议设置阴性对照(不加任何标记物)用于调节电压,单标对照(只加Annexin V-IF647,以及只加PI)用于调节补偿。
2) 流式细胞仪检测分析参考实例:用5µM Camptothecin诱导Jurkat T淋巴瘤细胞6h,参照以上实验步骤,用流式细胞仪进行检测。结果如下图所示:
IF647最大激发波长为656nm,最大发射波长为670nm;PI-DNA复合物的最大激发波长为535nm,最大发射波长为615nm。经流式细胞仪相关分析软件绘制双色散点图,IF647位于横坐标,PI位于纵坐标。在典型实验中,活细胞无荧光,散点位于左下第一象限。处于早期凋亡细胞有较强的粉红色荧光,散点位于右下第二象限。晚期凋亡细胞、坏死细胞呈现粉红色、红色双重荧光,散点位于右上第三象限。
2. 荧光显微镜检测:在载玻片上加6µL经Annexin V-IF647和PI双染的细胞悬液,盖上盖玻片,在荧光显微镜下用双色滤光片进行观察,Annexin V-IF647呈粉色荧光信号,PI呈红色荧光信号。
注意事项:
1. 整个实验过程操作应尽量轻柔避免细胞破碎,影响实验结果。
2. 用PBS清洗细胞不可省略,同时也要尽可能的去掉残留的PBS。
3. 使用胰酶消化细胞时,应小心操作,避免人为损伤细胞,并控制消化时间。消化时间过短,细胞需用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的机械损伤;若消化时间过长,细胞膜同样容易受到损伤。影响检测结果。另外不能使用含EDTA的胰酶,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
4. 贴壁细胞经凋亡刺激后,如有部分细胞漂浮,需同时收集细胞培养上清液及贴壁细胞合并染色,会使得结果更加准确。
5. Annexin V-IF647和PI对光敏感,操作时注意避光,反应结束后应尽快进行检测。
6. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
7. 本产品仅限于专业人员科学研究使用,不得用于临床诊断和药品等用途。
品牌: | 爱普科学 |
英文名称: | Annexin V-IF647/PI Cell Apoptosis Detection Kit |
规格: | 50T/100T |
性状: | 液体 |
储存温度: | 2-8℃ |
保质期: | 12个月 |
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