储存条件：4℃保存和运输，有效期12个月。

产品概述：

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞调亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的C2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与调亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期调亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞调亡的发生。

碘化丙啶(Propidium lodide,.PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对调亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

本试剂盒可应用于培养细胞调亡检测（不推荐用于检测组织样本）。

使用方法：

1. 悬浮细胞离心(2000rpm离心5min)收集：贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集。注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性。

2. 用PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1~5×105细胞。

3. 加入500uL的Binding Buffer悬浮细胞。

4. 加入5uL Annexin V-FITC混匀后，加入5uL Propidium Iodide,混匀。

5. 室温、避光、反应5~15min。

6. 请在1h内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。

A. 荧光显微镜观察：

1. 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。

2. 对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞调亡。

3. 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组。

4. 用PBS洗涤细胞两次。

5. 在500uL的Binding Buffer中加入5uL Annexin V-FITC，5uL Propidium lodide，混匀。

6. 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使盖玻片表面均匀覆盖。

7. 避光、室温反应5min。

8. 将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片(FTC和罗丹明)观察。Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。

B. 流式细胞仪分析：

1. 用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=530 nm。

2. Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测：PI红色荧光（流式Ex=488 nm，Em≥630 nm)通过FL2或FL3通道检测，建议使用FL3。

3. 荧光补偿调节：使用经调亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

C. 实验范例：

用凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡，在37℃，5% CO2培养箱培养4~6h后，参照说明书的操作方法进行检测，经流式细胞仪检测结果见下图。

注意事项：

1. 微量试剂取用前请离心收集。

2. Annexin V-FITC,Propidium lodide(PI)避光保存及使用。

3. Propidium lodide(PI)有毒，操作时要戴手套.

4. 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低1×105，不推荐用于检测组织样本。

5. 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2% BSA的PBS中，防止进一步的损伤。

6. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。

7. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经调亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

8. 为了您的安全和健康，请穿戴实验服并戴一次性手套操作。

9. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或药品等用途。

产品说明书.pdf