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适用范围:适用于快速提取真菌组织细胞基因组DNA。
产品储存:本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:
1. 缓冲液AP1、AP3/E低温时可能出现析出和沉淀,可以在65℃水浴几分钟帮助重新溶解(AP3加入乙醇前可加热,加入乙醇后不可加热),恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍:
该试剂盒采用DNA吸附柱和新型独特的溶液系统,适合于从真菌组织细胞中快速简单地提取基因组DNA。可在30分钟内完成一个或多个100mg新鲜或20mg干燥的真菌样品DNA的纯化工作。提取过程不需要用到有毒的酚氯仿等有机物抽提,也不需要用到耗时的异丙醇或乙醇沉淀,并能快速高效地去除多糖类、酚类和酶抑制物等杂质,纯化的DNA可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。
新鲜或干燥的真菌组织(细胞)磨碎后经裂解液裂解;蛋白质、多糖、细胞残片被沉淀去除;然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,进一步将多糖,多酚和细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点:
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好,克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 操作安全,不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
3. 快速简捷,单个样品操作一般可在1小时内完成。
4. 数种去多糖、多酚成份和多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。
注意事项:
1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
2. 开始实验前将需要的水浴先预热到65℃备用。
3. 缓冲液AP3/E中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. 不同来源的真菌组织细胞材料中提取DNA的量会有差异,一般100mg新鲜组织典型产量可达3-25μg。
5. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
6. 真菌种类复杂,没有一种试剂盒可以提取所有种类的真菌DNA。如果有的真菌多糖多酚含量过于丰富、次级代谢产物太复杂导致本试剂盒效果不佳,可以选择本公司的PD202 CTAB法植物DNA提取试剂盒提取真菌,一般该试剂盒对于多糖多酚次级代谢产物复杂的真菌DNA提取效果良好。
操作步骤(实验前请先阅读注意事项):
提示:第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!第一次使用前请先在缓冲液AP3/E中加入指定量无水乙醇!
1. 取适量真菌组织在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。
2. 转移细粉(新鲜真菌组织100mg或干重组织20mg)到一个1.5mL离心管,不要解冻,加入400μL缓冲液AP1和4μL RNase A(10mg/mL),旋涡振荡,充分混匀帮助裂解。
注:如果组织裂解困难,可根据需要加一个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。大多数情况下不需要离心去除未完全裂解的组织,因为后面有一个离心去除的步骤。
可选:多糖含量特别高的时候可以在AP1加入2% PVP40,000;多酚含量特别高的时候可以在AP1中加入0.2% beta巯基乙醇。也可两者同时加入。
3. 65℃水浴10分钟,在水浴过程中颠倒离心管2-3次,混合样品。
4. 加入130μL缓冲液AP2,充分混匀,冰上放置5分钟,14,000rpm 离心5-10分钟,小心吸取上清到一个新的1.5mL离心管,注意不要吸到界面物质。
5. 计算上清量,加入1.5倍体积的AP3/E(请先检查是否已加入无水乙醇!),立即吹打混匀。
注:加入AP3/E可能会出现絮状沉淀,但不影响DNA提取。注意将AP3/E直接加入到上清并立即吹打混匀。
6. 将上一步所得混合物(包括可能出现的沉淀)加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液(先加650μL离心,弃废液,再加入剩余的溶液,再次离心)。
7. 加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。
8. 加入600μL漂洗液WB,12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。
9. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
10. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB,室温放置3-5分钟,12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟。
注:洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果预计和需要产量高,可增大洗脱体积,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于50μL,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
11. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
问题与解决方法:
问题 | 评论与建议 |
DNA产量低 | * 处理材料过量或者裂解不完全-建议:使用适量的起始材料,充分研磨或者匀浆。 * 结合条件不恰当-建议:步骤5精确估计上清量,加入1.5倍体积AP3/E量要准确。 |
RNA残留 | * 真菌RNA含量太丰富-建议:提高RNase A处理浓度。 |
未提取到DNA | * 漂洗液WB中忘记加无水乙醇-建议:第一次实验时,在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇。 |
离心柱堵塞 | * 研磨裂解不充分,团块多;裂解物太粘稠;离心力太小-建议:参见步骤2,加一个离心步骤去除;减低起始材料量,不要处理过量,加大离心力。 |
洗脱下来的DNA溶液 带颜色或者膜上有明显 的色素残留 | * 漂洗次数不够-建议:步骤8完成后,加500μL乙醇再漂洗一遍。 * 起始材料太多过量-建议:减少起始处理材料,不要过量。 |
洗脱下来的DNA 产量低 | * 离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇-建议:确保做了步骤9,否则残留乙醇会影响洗脱效率。 * 使用了水或者其它非最佳液体代替洗脱缓冲液-建议:仔细阅读步骤10和注意事 项5和只使用洗脱缓冲液EB洗脱。 * 洗脱缓冲液量偏低-建议:使用200μL洗脱缓冲液洗脱。 |
A260吸光值异常偏高 | * 一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了吸光值-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。 |
DNA下游酶切不能切开 或者酶切不完全 | * 一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。 * 离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反应-建议:确保做了步骤9,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。 |
品牌: | 爱普科学 |
产品别名: | AipBest Fungal Genomic DNA Rapid Extraction Kit(Centrifugal Column) |
规格: | 50T/100T/200T |
性状: | 液体 |
储存温度: | RT |
保质期: | 12个月 |
产品说明: | 收到产品后,请尽快按照试剂盒内各组分的储存温度保存! |
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