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产品储存:4℃运输,-20℃保存,有效期24个月。
产品浓度:5U/µL。
适用范围:一般用于DNA片段的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、序列测定、DNA平未端加A等,产物可直接用于TA克隆。
制品说明:一般PCR法具有一定的局限性,特别是难以扩增5kb以上的长链DNA,这严重限制了PCR法的推广和应用。通过改变PCR用DNA聚合酶、PCR用Buffer、PCR扩增条件等,使长链DNA的扩增成为可能,这就是LA(Long and Accurate)PCR技术。本试剂盒所用的Long Taq是Taq聚合酶和有校正功能的聚合酶的混合酶,这种混合酶可以染色体和其它细胞器的DNA为模板高效进行PCR反应。在人的染色体上可以扩增长度可达27kb的DNA片段,而以λDNA为模板则可以扩增出高达40kb的片段。
举例说明:(按下列组份配制50µL PCR反应液)
Components | Volume(50μL) |
Long Taq(5U/μL) | 0.5-1μL |
10×Long PCR Buffer(Mg2+ Plus) | 5μL |
dNTP Mixture(各2.5 mM) | 8μL |
模板DNA 2.5ng(λphage)或者0.5μg(Human) 噬菌体(0.1-5ng),人基因组(0.1-1μg) | ?μL |
引物 1 (20μM) | 0.5-1μL |
引物 2 (20μM) | 0.5-1μL |
灭菌纯水 | up to 50μL |
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数目 |
预变性 | 94°C | 1-2分钟 | 1 |
变性 | 94°C | 10-20秒 | 10 |
退火 | 65°C(视引物而定) | 30秒 | |
延伸 | 68°C | 45-60秒/kb* | |
变性 | 94°C | 10-20秒 | 15-20 |
退火 | 65°C(视引物而定) | 30秒 | |
延伸 | 68°C | 45-60秒/kb+1-20秒 | |
最后延伸 | 68°C | 10分钟 | 1 |
PCR片段长度(kb) | 延伸时间(分钟) | 自动延长/循环(秒) |
3 | 2 | 1 |
6 | 4 | 2 |
10 | 7 | 5 |
15 | 10 | 5 |
20 | 14 | 10 |
25 | 17 | 10 |
30 | 20 | 15 |
35 | 24 | 15 |
40 | 27 | 20 |
45 | 30 | 20 |
*扩增大片段尤其是20kb以上的片段我们建议15-30循环时每个循环的延伸时间要增加10-15秒“自动延长”时间,如果PCR仪器没有“自动延长”功能,那么设定延伸时间时候建议在原有基础上面增加1-4分钟。
注意事项:
1. 10× Long Taq Buffer pH值较高,可能会形成[Mg(OH)2]沉淀,使用前要充分溶解,并Votex保证可能的沉淀重新溶解,或者37°C温育5分钟,然后Votex充分混匀。
2. 扩增长片段强烈推荐使用0.2μL薄壁管。其他试管未经测试。较厚的试管在92℃时不能有效地使模板变性。变性时,尽可能缩短变性时间,降低变性温度。第一步变性在92~94℃下进行2分钟(GC含量高可延长时间达5分钟)。在循环过程中尽可能缩短变性时间(92~94℃下进行10-15秒),除非模板中富含GC,则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌呤和链断裂,对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12kb时,应该尽可能的降低变性温度和时间。变性需要的时间在不同的PCR仪器上稍有不同。
3. 如果扩增模板GC含量高或者扩增片段比较长,可在反应混合物中加入DMSO到终浓度1%-8%,最常用2%(<30kb)或者4%(>30kb)往往会改善扩增效果。
4. 扩增长片段,引物一般终浓度为0.3-1μM,长度最好为27-36bp;退火温度一般在65℃-70℃,此时退火温度和延伸温度基本一致,可将退火延伸在同一个温度进行,使用2阶段扩增法。当然如果设计的引物在20bp左右,则还是使用传统3阶段扩增法为好。
5. 模板一般使用0.01-2.5ng(λphage)或者0.1-1μg(Human)。
6. 1× Long Taq Buffer中镁离子浓度为2.5mM,建议dNTP浓度为400mM,然而要得到最佳结果,优化Mg2+的浓度是必需的。如果含有较高EDTA或者螯合剂,则应该提高Mg2+;如果要增加dNTP浓度,相应也要增加Mg2+浓度。
7. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
8. 本制品仅供科研使用,严禁用于临床诊断和药物等用途。
品牌: | 爱普科学 |
产品别名: | Long Taq DNA聚合酶 |
规格: | 500U/3000U |
性状: | 液体 |
储存温度: | -20℃ |
保质期: | 24个月 |
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