适用范围：适用于快速提取植物组织细胞总RNA，使用独有基因组DNA清除柱技术可有效清除电泳可见gDNA残留，RNA可用于反转录PCR和荧光定量PCR等。

产品储存：本试剂盒在室温储存，12个月不影响使用效果。

储存事项：

1. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下(15℃－25℃)进行。

2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：本公司独家推出AipEasy无苯酚、氯仿RNA快速提取技术基础上，又独家研发成功基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，离心沉淀去除多糖多酚和次级代谢产物，然后裂解混合物用乙醇调节RNA结合吸附到基因组DNA清除柱，然后RNA被选择性洗脱滤过，吸附在基因组DNA清除柱上的残留DNA无法洗脱连同柱子一起丢弃从而清除掉DNA。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-free Water将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点：

1. 完全不使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2. 方便简捷，单个样品操作一般可在25分钟内完成，世界上最简单快速的试剂盒。

3. 独家研发成功基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。

4. 世界领先适应性极其广泛，可以提取包括复杂中草药如石斛/丹参/雪莲/人参、复杂淀粉种子如水稻/小麦/玉米种子、复杂果实如葡萄/蓝莓/草莓/西瓜果实、复杂抗逆植物如冬青/松针/沙棘/胡杨、复杂花卉月季/玫瑰/梅/牡丹花、复杂多糖植物紫菜/仙人掌/芦荟/百合鳞茎/水稻种子等数百种国内外试剂盒提取失败的样品，都可以咨询爱普科学购买本款试剂盒进行提取，提取效果再同行中遥遥领先。

5. 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值高达2.1～2.2，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot，二代测序和各种实验。

注意事项：

1. 所有的离心步骤均可在室温完成(4℃离心也可以)，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2. 需要自备β-巯基乙醇，乙醇，研钵(可选)。

3. 样品处理量绝对不要超过基因组清除柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。

4. 裂解液CLB和RLT Plus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5. 关于DNA的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留(DNase消化也无法做到100%无残留)，本公司的AipEasy RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

1) 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。

2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。

3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(Clean up)，请联系我们索取具体操作说明书。

4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I柱上消化处理。购买DNA酶柱上消化试剂盒(货号：RE280)前可先索取具体操作说明书。

操作步骤(实验前请先阅读注意事项)：

提示：第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇！取1mL裂解液CLB至离心管内(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65℃水浴重新溶解)，在裂解液CLB中加入5% β-巯基乙醇(1mL CLB加50μl β-巯基乙醇)。颠倒混匀后65℃水浴中预热。多个样品按照比例放大准备。

1. 直接研磨法(实验室无液氮情况下或者柔软易研磨植物样品推荐此法):

a. 新鲜植物组织或者冰冻保存样品称重后取100mg-200mg(水分少的样品如叶片种子等可加100mg-150mg，水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些)迅速剪成小块放入研钵，加入1mL CLB(已加有β-巯基乙醇)室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液CLB立刻充分接触以抑制RNA酶活性。

注：β-巯基乙醇是裂解液CLB的关键成分，必要的时候可以提高终浓度到10-20%。如果特别复杂植物，可以尝试在裂解液中加入PVP40至终浓度2%。

b. 将裂解物转入离心管，立即剧烈振荡15秒，短时放回65°C水浴中(5-10 min)，中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。13，000rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。

c. 取裂解物上清(在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量)转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

注：若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。

d. 立刻接操作步骤的步骤3。

2. 液氮研磨法(适用广泛，提取复杂难破碎，易降解样品时推荐此法):

a. 液氮中研磨新鲜或-70°C冷冻的材料至细粉。

b. 转移100mg-200mg细粉(水分少的样品如叶片种子等可加100mg-150mg，水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些)加至预热的裂解液CLB(已加有β-巯基乙醇)离心管中。立即剧烈涡旋30-60秒或者用吸头吹打混匀裂解直得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。

c. 短时放回65°C水浴中(5-10 min)，中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。

d. 将裂解物13,000 rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。

e. 取裂解物上清(在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量)转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

注：若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。

f. 立刻接操作步骤的步骤3。

3. 将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中，(清除柱放入收集管中)13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。

注：确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

4. 将基因组DNA清除柱子放在一个干净2mL离心管内(不用RNase-free 或者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管)，在基因组清除柱内加500μl裂解液RLT Plus，13,000 rpm离心30秒，收集滤液(RNA在滤液中)，用微量移液器较精确估计滤过液体积(通常为450-500μl左右，滤过时候损失体积应该减去)，加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

5. 立刻将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心2分钟，弃掉废液。

注：确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

6. 加700μl 去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

7. 加入500μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!)，13,000rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，重复一遍。

8. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9. 取出吸附柱RA，放入一个RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase-free Water(事先在70-90℃水浴中加热可提高产量)，室温放置1分钟，12,000rpm 离心1分钟。

10. 如果预期RNA产量>30μg，加30-50μl RNase-free Water重复步骤9，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。

注：洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。

附录1：DNA酶柱上消化(详细请参考RE280 DNase I柱上消化试剂盒说明书)

1. 按照前面所列RE215试剂盒操作步骤操作，直到做完操作步骤5。

2. 取45μl DNase I buffer和5μl RNase-free DNase I在离心管轻轻吹打混匀成工作液(处理多个离心柱子要按照比例放大制备工作液)。

3. 向吸附柱RA中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm 离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

4. 向吸附柱RA中央加入50μl的DNase I工作液，室温(20℃-30℃)放置15分钟。注意直接将工作液滴在膜中央上向膜四周浸润充分和膜接触，不要让工作液滴在O型垫圈或是离心柱管壁上挂壁或者挂在垫圈上不能充分和膜接触。

5. 向吸附柱RA中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm 离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

6. 接着做操作步骤7，并完成后续所有步骤。

附录2：RNA含量少样品或者RNA复杂产量低的解决方案

可以提高样品处理量到300-500mg/2mL裂解液CLB，上清过两根基因组DNA清除柱子，洗脱下来的RNA，可以两个合并到一根RNA吸附柱上，可以大大提高RNA浓度。

产品说明书.pdf