适用范围：适用于抗凝全血、组织、细胞、鼠尾和细菌等基因组DNA提取。

产品储存：本试剂盒在室温储存和运输，保质期12个月。

储存事项：

1. 裂解液TL、结合液CB、或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

2. 蛋白酶K保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输。收到后，不超过25℃室温至少保存6个月，4℃保存12个月，－20℃保存2年。

3. 避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：本试剂盒独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，利用硅胶膜离心柱特异的吸附DNA，无需苯酚和氯仿等有毒试剂，也无需进行乙醇沉淀，即可最大限度的去除蛋白及其他抑制性杂质。适用于从多种样本(全血、动物组织、动物细胞、鼠尾、大肠杆菌等)中高效的提取基因组DNA。提取的DNA可直接用于酶切、PCR、Southern Blot、病毒检测、各种酶切等相关实验。

产品特点：

1. 操作安全，不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要复杂的乙醇沉淀等。

2. 快速简捷，单个样品操作一般可在30分钟内即可完成。

3. 多次柱漂洗确保高纯度， OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达30kb -50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应等实验。

4. 从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全，客户可根据需要选择购买。

5. 提取效果极佳，典型的200µL全血可提取出3-6µg产量的高品质基因组DNA。

注意事项：

1. 所有的离心均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

2. 需要自备乙醇、异丙醇、1× PBS/磷酸盐缓冲液(可选)、RNase A(可选)、溶菌酶(用于革兰氏阳性菌，可选)。

3. 不同样品尤其疾病样品中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大。

4. 开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。

5. 为了最佳效果，最好使用新鲜血液标本或者4℃存放少于3天的标本，不要使用反复冻融超过3次的标本，否则产量会严重降低。

关于平衡液的使用：

1. 产品介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存即可。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至37℃使沉淀完全消失即可。

2. 使用方法：(使用前务必进行预处理)取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μL的平衡液至柱子中。13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤即可。

操作步骤(实验前请先阅读注意事项)：

提示：第一次使用前，请先在漂洗液WB中按照组分标签上的提示加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入！

平衡液预处理吸附柱备用：使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液的使用”

1. 全血样本

1) 取200ul新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，放入1.5mL离心管。

注：如果全血起始量小于200μL，则用1× PBS补足到200μL。如果起始量介于200μL-300μL之间，则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μL-1mL之间，则需要先进行红细胞裂解操作(见本说明书后附录)。

注：如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，因此处理量5-20μL，可加1× PBS补足到200μL后进行后续步骤。

2) 加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，充分混匀，再加入200μL结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟。溶液应变清亮(但颜色偏黑色)。

可选做步骤(一般不需要)：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μL结合液CB前加20μL RNase A(25mg/mL)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。

3) 冷却后加100μL异丙醇(也可用无水乙醇替代)，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

注：上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分会严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。

4) 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。

5) 接操作步骤项下6。

2. 组织培养细胞

1) 收集约105-106悬浮细胞到一个1.5mL离心管；对于贴壁细胞，应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。

2) 13,000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。吸弃上清，留下细胞团。

3) 加200μL 1× PBS重悬洗涤细胞，13,000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，将细胞沉淀重悬于180μL 1× PBS中。

4) 加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，充分混匀，再加入200μL结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟。

可选做步骤：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μL结合液CB前加20μL RNase A(25mg/mL)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。

5) 冷却后加100μL异丙醇(也可用无水乙醇替代)，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

6) 将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。

7) 接操作步骤项下6。

3. 动植物组织(例如鼠肝脑或者植物叶片)

1) 将20-50mg新鲜或者解冻的组织用解剖刀切成小碎块(切成小块可以提高产量)或者在液氮中研磨组织成细粉后，转入装有180μL组织裂解液TL的1.5mL离心管中，用大口径枪头吹打混匀。

2) 加入20μL的蛋白酶K溶液(20mg/mL)，立刻涡旋振荡充分混匀。

3) 将裂解物放置在55℃水浴1-3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。

可选做步骤：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可在完成步骤3后加20μL RNase A(25mg/mL)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。

4) 加入200μL结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置10分钟。

5) 冷却后加100μL异丙醇(也可用无水乙醇替代)，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

6) 将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。

注：如果有不溶组织物可能堵住枪头，可将枪头在吸水纸上轻蹭去除不溶物；如果吸上来的混合物少则可以将枪头和不溶物一起弃去，该做法是为了去除不溶物，以免堵塞离心柱。

7) 接操作步骤项下6。

4. 动物组织(鼠尾)

1) 将0.2-0.5cm的鼠尾巴尖(即20-50mg)剪碎(一定要剪0-2cm范围内的尾巴尖，否则裂解效果不好)，或者在液氮中研磨组织成细粉后，转入装有180μL组织裂解液TL的1.5mL离心管中，用大口径枪头吹打混匀。

2) 加入20μL的蛋白酶K(20mg/mL)，立刻涡旋振荡充分混匀。

3) 将裂解物放置在55℃水浴3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。

可选做步骤：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可在完成步骤3后加20μL RNase A(25mg/mL)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。

4) 用一个1mL不带针头的一次性注射器抽打裂解物2-3次。

5) 加入200μL结合液CB和100μL异丙醇(也可用无水乙醇替代)，立刻涡旋振荡充分混匀。

6) 13,000rpm离心5分钟，将上清加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。

7) 接操作步骤项下6。

5. 细菌样本

1) 取0.5-2mL培养菌液(最多不超过2×109个细胞)，10,000rpm离心30秒，尽可能的吸弃上清，收集菌液。

注：起始处理量可以根据细菌密度、细胞种类、预期产量进行调整，但是离心吸附柱最大吸附能力是30μg基因组DNA，如果菌体过量超过最大吸附能力，反而会严重降低产量。

2) 加入200μL 1× PBS重悬，10, 000rpm 离心30 sec，吸弃上清。将细胞振荡或者吹打充分重悬于180μL 1× PBS中。

注：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，可略过步骤2，加入溶菌酶进行破壁处理，具体方法为：加入180μL缓冲液(20mM Tris, pH 8.0；2mM Na2-EDTA；1.2% Triton X-100；临用前加入终浓度为20mg/mL的溶菌酶(溶菌酶必须用溶菌酶干粉溶解在缓冲液中进行配制，否则会导致溶菌酶无活性))，37℃处理 30 min 以上。

3) 加入20μL蛋白酶K溶液，充分混匀，再加入200 μL结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70°C放置 10 min。

可选做步骤：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200 μL结合液CB前加20μL RNase A(25mg/mL)溶液，振荡混匀，室温放置5-10 min。

4) 冷却后加100μL异丙醇(也可用无水乙醇替代)，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

5) 将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13, 000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中的废液。

6) 接操作步骤项下 6。

6. 加入500μL抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。

7. 加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

8. 重复步骤7一遍。

9. 将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在80-100℃水浴中预热可提高产量)，室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。

注：可将第一次洗脱所得溶液重新加入离心柱中，室温放置2分钟，13,000rpm离心1分钟，可以提高浓度10%左右。

注：洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μL，体积过小会降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

11. DNA短期存放，可以存放在-20℃，如果需要长时间存放，可以放置在-70℃保存。

附录：(以300μL，1mL全血举例红细胞裂解操作)

1. 吸取900μL红细胞裂解液到一个1.5mL离心管或者3mL红细胞裂解液到一个15mL离心管。(红细胞裂解液可向本公司购买)

2. 将抗凝全血(使用前回复到室温)颠倒混匀后，吸取300μL全血和1mL全血分别加到上述1.5mL和15mL离心管中，颠倒6-8次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀。

3. 室温放置10分钟(期间应该颠倒轻弹混匀数次，帮助裂解红细胞)。

4. 12,000rpm离心20秒(对于1.5mL离心管)或2,000-3,000rpm离心5分钟(对于15mL离心管)，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管底的细胞团)，留下完整的管底白细胞团和大约10μL的残留上清。

注：离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3和步骤4。

5. 加入200μL 1× PBS涡旋振荡重悬白细胞团，充分分散白细胞团。

注：其中由于肝素抗凝血的白细胞沉淀团很难打散重悬，影响后续实验裂解效果，建议选用非肝素的抗凝剂收集血液标本。

6. 现在可以按照操作提取全血基因组DNA了。

产品说明书.pdf