产品储存：－20℃储存，至少6个月内不影响使用效果。

产品介绍：本载体采用了世界最先进的Directional Topoisomerase Cloning(定向拓扑异构酶克隆技术)可以在5分钟内将待表达目的基因(高保真酶扩增的平末端片段)一步法定向克隆到高效pET增强型载体，利用T7lac启动子进行严谨调控，高效表达。

1. 简单快速，加入待表达基因片段室温仅需5分钟便可完成原核表达载体构建。

2. 定向克隆技术，超过90%插入为正确方向插入，减少克隆筛选耗费的时间。

3. T7lac启动子严谨调控本底表达，实现表达过程的可控和高效表达。

4. 氨苄抗性标记筛选，N端和C端6´ Histag标签方便表达后纯化。

5. 带肠激酶(EK)酶切位点，可以方便将标签切除得到不带标签的蛋白。

测序可以采用T7/T7 ter通用引物测序(见后面图谱)

操作步骤：

1. 待表达目的基因扩增引物设计原则：

1) 为了达到定向克隆的目的，上游引物5' 端应该加上额外的4个碱基CACC，这样PCR产物的5’端可以和载体上突出的GTGG互补配对，从而达到定向克隆的目的。

举例：

待表达序列：5′-ATG GGA TCT GAT AAA ...

设计上游引物：5′-CACC ATG GGA TCT GAT AAA...

2) 如仅需在N端加上6´ Histag标签，则下游引物的起始端应该加上终止密码子(密码子序列应该为反向互补序列，例如终止密码子是TGA，那么下游引物起始为TCA)

3) 如需在N端和C端同时加上6´ Histag标签，则下游引物的起始端应该不包含终止密码子；为达到定向克隆的目的，下游引物5' 起始应该不包含CACC，这样可以避免PCR产物的3’端也可以和载体上突出的GTGG互补配对而造成错误方向的插入。

2. 连接反应的准备：PCR引物不能磷酸化。使用扩增产物是平末端的高保真聚合酶系列扩增(如Pfu、Vent、Phusion DNA Polymerase)。PCR产物(仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体)可直接进行连接反应，无需纯化，否则建议琼脂糖凝胶DNA纯化回收(货号：DR201)。如果是以质粒为模板的PCR产物则最好进行纯化，因为模板质粒也可能长出菌落(但不是想构建的目的载体)。

3. 连接反应：

1) 室温(25℃-37℃)设立10μL连接体系(建议用0.2mL PCR管，PCR仪器控温)：

加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底，注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温(20℃-30℃)进行。

不同大小插入片段的推荐用量：

2) 室温(25℃-37℃)连接5分钟。

注：本载体推荐室温5分钟完成连接。长片段或者连接困难片段可以延长连接时间到15分钟，温度可选37℃，可显著增加转化子数量。

3) 连接产物可直接转化克隆感受态细胞(如DH5a，TOP10等)或贮存于-20℃。

注：如尚未准备好感受态细胞，可以将连接产物短时间置于冰上备用。

4. 转化：

1) 50-100μL感受态细胞，置于室温解冻，完全解冻后(约1分钟左右)轻掸几次将细胞均匀悬浮。

2) 加入5μL连接液(最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的1/10)，轻轻混匀，在冰浴中放置30分钟。

3) 将离心管置于42℃水浴中放置60-90秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，该过程不要摇动

4) 加500μL LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃ 180rpm振荡培养60分钟。

注：根据我们的经验，一般可以直接将培养基(事先平衡至室温)加入感受态细胞的1.5mL离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可，不需要转移到试管培养复苏。

5) 取200μL菌液涂板，培养过夜(如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000rpm 离心1 min，吸弃掉部分上清，保留 100-150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板)

5. 转化子的筛选鉴定：

1) 菌落PCR检测/提取质粒内切酶酶切鉴定阳性克隆。

2) 用T7 Promoter /T7 Terminator通用引物测序，来确定是否含有目的克隆。

6. 目的基因表达：

感受态细胞：BL21(DE3)表达感受态细胞系列均可用于表达。转化阳性克隆质粒于BL21(DE3)感受态细胞系列进行表达。如果表达毒性基因，建议选择BL21(DE3)pLysS感受态细胞。

诱导：挑选单克隆，接种于5mL LB/Amp+培养基中，37℃250rpm培养，当OD600=0.5至0.8时(首选0.6)，加入终浓度为0.5-1mM的IPTG诱导表达。为了得到最大量表达，建议试验不同的诱导时间。

验证纯化：表达结束后，收集菌体沉淀，经过SDS-PAGE跑胶染色检测蛋白的表达情况，HIS标签蛋白可用镍柱亲和层析纯化。

pTOPO-D1载体图谱：

pTOPO-D1载体多克隆位点序列：

产品说明书.pdf