AipScript SYBR Green Two-Step qRT-PCR Kit
货号:QP101-01
品牌:爱普科学
货期:现货
价格:¥1400
- 产品介绍
- 商品属性
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- 产品问答
包 装 量:
目录编号 | 包装单位 |
QP101-01 | RT311-01和FP301-01 |
QP101-02 | RT311-02和FP301-01 |
试剂盒组成 | 产品货号 | 产品规格 |
AipScript First-Strand cDNA Synthesis RT-PCR Kit | RT311-01 | 50次*20uL |
RT311-02 | 100次*20uL | |
AipMix 2× SYBR Green qPCR SuperMix | FP301-01 | 1.25mL(125次*20uL) |
储存温度:-20℃保存,有效期12个月。
产品说明:本产品由两个试剂盒组合而成。
一个是:第一链反转录合成试剂盒AipScript First-Strand cDNA Synthesis RT-PCR Kit(货号:RT311)。
一个是:AipMix 2× SYBR Green qPCR SuperMix(货号:FP301)。
首先由反转录第一链试剂盒合成cDNA,然后以cDNA做模板用2× SYBR Green qPCR Mix进行荧光定量PCR扩增。
使用说明:请按照上述两个试剂详细步骤说明进行实验。
RT311使用说明书
包 装 量:
目录编号 | 包装单位 |
RT311-01 | 50次*20uL |
RT311-02 | 100次*20uL |
Components | RT311-01 | RT311-02 |
5× Aip Reaction Mix | 200μL | 400μL |
Oligo(dT)(0.5μg/μL) | 50μL | 100μL |
Random primer(N6) | 50μL | 100μL |
RNase free Water | 1mL | 1.5mL |
产品储存:-20℃保存,有效期12个月。
制品说明:
本制品以RNA为模板,采用预混合技术,用5× Aip Reaction Mix(已经预混合了AipScript Hˉ RTase、RNase Inhibitor、dNTP Mixture、Buffer)高效合成第一链cDNA,操作简单。
本制品采用分子进化技术多点突变的新一代反转录酶,具有更强的延伸能力和稳定性,可用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。
适用范围:第一链cDNA合成。可用于高拷贝、低拷贝基因的检测。
产品特点:
1. 新一代反转录酶大幅度提高了稳定性和反转录效率。合成cDNA长度高达12kb以上。
2. 全预混的反转录Mix,只需加入RNA、引物和水,简单快速完成反转录。
3. RNA模板的体积最多可加到总体积的75%,非常适合于低浓度RNA模板的逆转录反应。
4. 预混合Mix在-20℃不冻结,减少了化冻和混匀时间,使用更简单。
5. 用户可根据需要,可灵活选择Oligo(dT)、Random primer或基因特异引物作为逆转录引物。
引物选择:
1. 如果模板为真核生物来源,一般情况下首选Oligo(dT),与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对,可获得最高产量的全长cDNA。
2. 如果对一些物种,不能确定mRNA是否有polyA尾的情况下,首选Oligo(dT),不成功再尝试基因特异性引物(GSP)和Random primer为引物。
3. 基因特异性引物(GSP)的特异性最高。但有些情况下,用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成,可改用Oligo (dT)或Random primer重新进行逆转录。
4. Random primer特异性最低,所有RNA,包括mRNA,rRNA,tRNA均可以作为Random primer的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高,或者模板为原核生物来源,使用Oligo(dT)或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成时,可使用Random primer为引物。
5. 如果合成cDNA下游用于荧光定量PCR,可将Oligo(dT)与Random primer混合使用(各加1μL/20μL反应体系),可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同,有助于提高定量结果的真实性和重复性。
第一链cDNA合成:(以20μL反应体系为例)
1. 加入以下成分(使用前将每种溶液轻弹或者轻微涡旋振荡混匀,可简短离心收集液体到管底。)
Components | Volume |
Total RNA/mRNA | 50ng-5μg/5-500ng |
Oligo(dT)(0.5μg /μL) or Random Primer(0.1μg/μL) or GSP(Gene Specific Primer, 2pmol/μL) | 1μL |
5× Aip Reaction Mix | 4μL(见注意事项4) |
RNase free Water | to 20μL(补足到总体积20μL) |
2. 轻轻混匀
如用Oligo(dT)或基因特异引物(GSP),42℃孵育30-50 min(如产物用于qPCR,42℃孵育15 min)。
如用Random Primer,25℃孵育10 min,42℃孵育30-50 min(如产物用于qPCR,42℃孵育15 min)。
注意:如果模板具有复杂二级结构或高GC区域,可尝试将反应温度提高至50℃,有助于提高产量。
3. 85℃加热5 sec失活AipScript Hˉ RTase。
4. 得到的cDNA产物可立即用于PCR反应,或在-20℃保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-70℃保存。cDNA应避免反复冻融。
RT-PCR:建议取1/10-1/5体积(2-4μL)的反转录产物作为PCR模板。丰度高的可以酌情适当稀释cDNA后使用。
建议PCR条件:请按照选择的爱普科学PCR试剂或者其它厂家PCR试剂说明书进行。
建议爱普科学配套PCR试剂:
1. 常规扩增:GP127-AipMix 2× Taq PCR MasterMix(+Dye)
GP124-AipMix 2× F8 FastLong PCR MasterMix(+Dye)
2. 高保真扩增:GP111-AipMix 2× A8 FastHiFi PCR MasterMix(+Dye)
GP112-AipMix 2× A9 LongHiFi PCR MasterMix(+Dye)
注意事项:
1. 避免RNase污染。
2. 为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。
3. 可选步骤(一般不需要):如果RNA模板GC含量丰富或者有复杂二级结构、或者扩增cDNA长度超过3kb,可以先只加RNA模板、引物和和RNase free Water混匀,65℃变性5分钟,冰上冷却,短暂离心后加入其它成分继续下面的反转录步骤。
4. 5× Aip Reaction Mix非常粘稠,溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失,用前请点甩离心后使用,并且避免吸头外壁沾附损失。5× Aip Reaction Mix内包含的酶均为过量,即使每次按照3.6μL-3.8μL使用,也不影响使用效果。
FP301使用说明书:
包 装 量:
目录编号 | 包装单位 | 产品规格 |
FP301-01 | 1.25mL | 125次*20uL |
储 存:-20℃避光保存,有效期24个月;使用前充分融解混匀;短期使用可放在4℃,避免反复冻融。
制品说明:
本制品本制品是采用SYBR® Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。已经将热启动HotMaster Taq DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液、BSA和SYBR® Green I等试剂预混成一种适合Real Time PCR反应检测用2× Premix Type试剂,具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板和引物和水,便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对目的基因进行准确定量检测,重复性好,可信度高。
本品采用全新的Hotmaster Taq DNA聚合酶,该酶不同于一般Hot-start酶之处在于,一般的Hot-start酶只在第一步温度升高之前封闭酶的活性,而Hotmaster Taq DNA聚合酶是利用抑制剂通过温度调节方式封闭Hotmaster Taq DNA聚合酶的底物结合位点,温度低于40℃时,形成非活性的酶-抑制剂复合物,当温度升高至引物特异性的退火温度时,结合平衡向模板-特异性引物复合物形成方向移动,因此最大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生,大大提高了荧光定量PCR反应的精确性。
注意事项:
1. 本制品不含参比染料ROX,客户须根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加入ROX参比染料,用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差,配套参比染料为:ROX Reference Dye(100×)(货号:FP307)。
2. 本制品含SYBR® Green I 强光下易分解,降低敏感度,使用时避免长时间强光照射本制品。
3. 建议在冰上配制PCR反应液,再放入PCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性,减少背景。
4. 本制品含有4mM MgCl2(反应体系终浓度是2mM Mg2+),可用25mM MgCl2 优化Mg2+浓度。
建议PCR条件:(以25μL和50μL反应体系为例,反应液配制请在冰上进行)
Components | Volume(25μL) | Volume(50μL) | Final Concentration |
2× SYBR qPCR Mix | 12.5μL | 25μL | 1× |
DNA Template | 1μL | 2μL | as required |
Forward Primer(10μM) | 0.5μL | 1μL | 0.2μM each |
Reverse Primer(10μM) | 0.5μL | 1μL | 0.2μM each |
ddH2O to final volume | 25μL | 50μL | Not applicable |
说明:本制品兼容性强,适用于不同厂家、型号的荧光定量PCR仪,绝大多数情况下使用二步法和三步法均可获得良好效果。在实际使用中可以根据机型推荐和具体情况对程序加以微调。一般来说,二步法扩增特异性高,三步法扩增效率高。如果融链曲线较差,可以尝试两步法扩增;若因使用Tm值较低的引物等原因,得不到良好的实验结果时,可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。
荧光定量PCR实验常见问题和解决方案:
A1:无信号值出现
Q1:
1. 反应循环数不够。一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45cycles),但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2. 检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3. 引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。
4. 引物或探针的设计,如探针高于引物的温度不够,造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5. 模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6. 模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
A2:CT值出现过晚
Q2:
1. 扩增效率低,反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。
2. PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3. PCR产物太长。一般采用100-150bp的产物长度,一般不超过500bp。
A3:标准曲线的线性关系不佳
Q3:
1. 加样存在误差,使得标准品不呈梯度。
2. 标准品出现降解。应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。
3. 引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。
4. 模板中存在抑制物,或模板浓度过高。
典型扩增曲线和融链曲线图(使用本制品在Roche Light Cycler 480 II 三步法操作实际图片)
品牌: | 爱普科学 |
产品别名: | 两步法荧光定量反转录PCR试剂盒 |
规格: | 50次*20uL/125次*20uL |
性状: | 液体 |
储存温度: | -20℃ |
保质期: | 12个月 |
产品说明: | 热销爆款! |
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